Modelos in vitro integrados para estudiar la influencia de las células endoteliales sobre el tráfico y el desarrollo de las CD – Metodología
Claramente, todavía se necesita mucho trabajo para entender los detalles moleculares y las consecuencias biológicas de las interacciones entre las CD y el endotelio. Una de las limitaciones para avanzar en este campo es la falta de un uso generalizado de sistemas de cultivo endotelial. Además, hasta ahora no existe ninguna fuente de endotelio linfático humano o murino cultivado. La identificación de varios marcadores moleculares restringidos al endotelio linfático, como la desmoplaquina (Schmelz et al., 1994), el receptor de VEGF-C Flt-4 (Kaipainen et al., 1995), LYVE-1 (Banerji et al., 1999) y Prox-1 (Wigle y Oliver, 1999), debería facilitar el establecimiento de endotelio linfático cultivado. Aquí se discuten métodos algo similares y bien caracterizados que utilizan monocapas HUVEC para estudiar la transmigración inversa. Un sistema modelo revisado que incorpore dos monocapas endoteliales, una de ellas de origen linfático si es posible, sería lo más ideal.
Las figuras 21.2 y 21.3 ilustran de forma esquemática dos sistemas de cultivo integrados que permiten el estudio de la migración transendotelial apical a basal, la diferenciación y la transmigración inversa a través de la misma monocapa endotelial. Las células endoteliales aisladas de las venas umbilicales (Jaffe et al., 1973) y cultivadas en suero humano al 20% o en suero bovino fetal sin factores de crecimiento adicionales se siembran en una matriz amniótica humana (Furie et al., 1984; Huang et al., 1988) o en una matriz de colágeno tipo I reconstituida (Muller et al., 1989) en uno o dos pases desde la siembra primaria (Figura 21.2). La siembra de endotelio en geles de colágeno reconstituidos es más eficaz si la matriz de colágeno se recubre con fibronectina justo antes de añadir las células endoteliales. En cambio, el crecimiento del endotelio sobre el amnios, una matriz extracelular humana nativa compuesta predominantemente por colágenos de tipo I y III (Lwebuga-Mukasa et al., 1984) y probablemente otros componentes de la matriz, no requiere la adición de fibronectina exógena. Por lo tanto, una ventaja de este último sistema es que es bastante sencillo preparar cultivos sin LPS, evitando el uso de fuentes comerciales de componentes de la matriz extracelular, en los que los niveles de LPS varían de un lote a otro. Otra característica del modelo HUVEC/amnios es que las soluciones tipo, como los quimioatrayentes (Huang et al, 1988), o los volúmenes de medio (Randolph y Furie, 1995) que bañan la superficie basal de los cultivos pueden controlarse o modificarse en cualquier momento según se desee, mientras que el aspecto basal de los cultivos que utilizan colágeno reconstituido está encerrado y es relativamente inaccesible a la manipulación (Figura 21.2).
Pesando estas desventajas, el sistema de colágeno reconstituido tiene una serie de ventajas, entre las que se incluyen una configuración menos laboriosa y una mayor reproducibilidad entre réplicas, ya que el grosor del amnios puede variar algo entre ellas. La mayor ventaja del modelo de gel de colágeno reconstituido es la posibilidad de incorporar partículas en la matriz (Figura 21.3), ya que las partículas fagocíticas potencian la diferenciación de monocitos a DCs.
En ambos sistemas modelo, los monocitos y otros precursores de DC que se añaden al aspecto apical de los cultivos migran a través del endotelio no estimulado (Figura 21.3). Un buen método fisiológicamente relevante para determinar que el endotelio no está realmente estimulado y que el sistema está libre de LPS es añadir neutrófilos a algunos pocillos de control, ya que estas células no migran a través de las monocapas endoteliales en reposo, pero migran fácilmente a través del endotelio estimulado (Huang et al., 1988; Furie y McHugh, 1989).
Para estudiar la transmigración inversa (Figura 21.3; véanse los métodos en Randolph y Furie, 1996; Randolph et al., 1998a, 1998b), el endotelio debe lavarse en medio después de que los monocitos se hayan incubado con las monocapas durante un tiempo suficiente para permitir la máxima transmigración hacia la matriz subyacente (1-2 horas). Este paso de lavado elimina las células que no se adhirieron o que se adhirieron débilmente al endotelio durante la incubación. Básicamente, todas las células que se adhieren al endotelio migran fácilmente a la matriz subendotelial (Muller y Weigl, 1992; Meerschaert y Furie, 1994). Normalmente, el medio de cultivo completo (como el Medio 199) elimina eficazmente las células no adherentes del compartimento apical, pero se puede utilizar una técnica más rigurosa en la que el endotelio se lava brevemente con un tampón libre de Ca2+ y Mg2+ que contiene 1 mmol/L de EGTA para interrumpir las interacciones integrina-ligando. A continuación, se añade un medio de cultivo completo y se continúa la incubación durante el tiempo suficiente para permitir la transmigración inversa (Figura 21.4). Los dos sistemas de cultivo difieren ligeramente en el tiempo medio de transmigración inversa: entre 24 y 36 horas en los cultivos de amnios (Randolph y Furie, 1996) y unas 48 horas en los cultivos de colágeno reconstituido (Randolph et al., 1998b). La recuperación de las células transmigradas en sentido inverso (por simple pipeteo desde el compartimento apical, como se detalla en Randolph et al., 1998b) es más eficiente en el modelo de gel de colágeno reconstituido cuando se establece en pozos de microtitulación, probablemente debido a una geometría más favorable. Si se establece como se describe, se recuperan alrededor de 15 000 células transmigradas inversamente por pozo de microtitulación (Randolph et al., 1998a, 1998b).