Actualmente existen varios métodos de etiquetado para el seguimiento de biomoléculas. Algunos de los métodos incluyen los siguientes.
Marcadores isotópicosEditar
Las especies comunes para las que se utilizan los marcadores isotópicos incluyen las proteínas. En este caso, los aminoácidos con isótopos estables de carbono, nitrógeno o hidrógeno se incorporan a secuencias de polipéptidos. A continuación, estos polipéptidos se someten a una espectrometría de masas. Debido al cambio definido exacto en el que incurren estos isótopos en los péptidos, es posible saber a través del gráfico de espectrometría qué péptidos contenían los isótopos. De este modo, se puede extraer la proteína de interés de varias otras en un grupo. Los compuestos isotópicos juegan un papel importante como fotocromos, descritos a continuación.
Biosensores colorimétricosEditar
Los biosensores están unidos a una sustancia de interés. Normalmente, esta sustancia no sería capaz de absorber la luz, pero con el biosensor unido, la luz puede ser absorbida y emitida en un espectrofotómetro. Además, los biosensores que son fluorescentes pueden verse a simple vista. Algunos biosensores fluorescentes también tienen la capacidad de cambiar de color en entornos cambiantes (por ejemplo, de azul a rojo). Un investigador podría inspeccionar y obtener datos sobre el entorno circundante basándose en qué color puede ver visiblemente de la especie híbrida biosensor-molécula.
Los ensayos colorimétricos se utilizan normalmente para determinar cuánta concentración de una especie hay en relación con otra.
Compuestos fotocromáticosEditar
Los compuestos fotocromáticos tienen la capacidad de cambiar entre una gama o variedad de colores. Su capacidad de mostrar diferentes colores radica en cómo absorben la luz. Las diferentes manifestaciones isoméricas de la molécula absorben diferentes longitudes de onda de la luz, por lo que cada especie isomérica puede mostrar un color diferente en función de su absorción. Entre ellos se encuentran los compuestos fotoconmutables, que son proteínas que pueden pasar de un estado no fluorescente a otro fluorescente dado un determinado entorno.
La molécula orgánica más comúnmente utilizada como fotocromo es el diareleteno. Otros ejemplos de proteínas fotoconmutables son el PADRON-C, el rs-FastLIME-s y el bs-DRONPA-s, que pueden utilizarse tanto en células de plantas como de mamíferos para observar el movimiento de las células en diferentes entornos.
BiomaterialesEditar
Los biomateriales fluorescentes son una posible forma de utilizar factores externos para observar una vía de forma más visible. El método consiste en marcar con fluorescencia moléculas de péptidos que alterarían la vía natural de un organismo. Cuando este péptido se inserta en la célula del organismo, puede inducir una reacción diferente. Este método puede utilizarse, por ejemplo, para tratar a un paciente y ver el resultado del tratamiento.
Sensores electroquímicosEditar
Los sensores electroquímicos pueden utilizarse para detectar biomoléculas sin etiquetas. Detectan cambios y miden la corriente entre un electrodo metálico sondeado y un electrolito que contiene el analito objetivo. A continuación, se aplica un potencial conocido al electrodo a partir de una corriente de retroalimentación y se puede medir la corriente resultante. Por ejemplo, una técnica que utiliza la detección electroquímica incluye el aumento lento del voltaje que provoca la oxidación o la reducción de las especies químicas en el electrodo. Se traza la corriente de la célula frente al voltaje, lo que en última instancia puede identificar la cantidad de especies químicas consumidas o producidas en el electrodo. Las etiquetas fluorescentes pueden utilizarse junto con los sensores electroquímicos para facilitar la detección en un sistema biológico.
Etiquetas fluorescentesEditar
De los diversos métodos de etiquetado de biomoléculas, las etiquetas fluorescentes tienen la ventaja de ser muy sensibles incluso a bajas concentraciones y de no destruir el plegamiento y la función de la molécula objetivo.
La proteína verde fluorescente es una proteína fluorescente natural de la medusa Aequorea victoria que se utiliza ampliamente para marcar proteínas de interés. La GFP emite un fotón en la región verde del espectro luminoso cuando se excita por la absorción de la luz. El cromóforo consiste en un tripéptido oxidado -Ser^65-Tyr^66-Gly^67 situado dentro de un barril β. La GFP cataliza la oxidación y sólo requiere oxígeno molecular. La GFP se ha modificado cambiando la longitud de onda de la luz absorbida para incluir otros colores de fluorescencia. La YFP o proteína amarilla fluorescente, la BFP o proteína azul fluorescente y la CFP o proteína cian fluorescente son ejemplos de variantes de la GFP. Estas variantes se producen mediante la ingeniería genética del gen GFP.
Las sondas fluorescentes sintéticas también pueden utilizarse como etiquetas fluorescentes. Las ventajas de estas etiquetas incluyen un tamaño más pequeño con más variedad de colores. Pueden utilizarse para etiquetar proteínas de interés de forma más selectiva mediante varios métodos, incluyendo el etiquetado basado en el reconocimiento químico, como la utilización de etiquetas de péptidos quelantes de metales, y el etiquetado basado en el reconocimiento biológico utilizando reacciones enzimáticas. Sin embargo, a pesar de su amplia gama de longitudes de onda de excitación y emisión, así como de su mayor estabilidad, las sondas sintéticas tienden a ser tóxicas para la célula, por lo que no suelen utilizarse en estudios de imagen celular.
Las etiquetas fluorescentes pueden hibridarse con el ARNm para ayudar a visualizar la interacción y la actividad, como la localización del ARNm. Una hebra antisentido marcada con la sonda fluorescente se une a una sola hebra de ARNm, y luego se puede visualizar durante el desarrollo celular para ver el movimiento del ARNm dentro de la célula.
Etiquetas fluorogénicasEditar
Un fluorógeno es un ligando (ligando fluorogénico) que no es en sí mismo fluorescente, pero cuando se une a una proteína o estructura de ARN específica se vuelve fluorescente.
Por ejemplo, FAST es una variante de la proteína amarilla fotoactiva que fue diseñada para unirse a imitaciones químicas del cromóforo del tripéptido de la GFP.Asimismo, el aptámero de espinacas es una secuencia de ARN diseñada que puede unirse a imitaciones químicas del cromóforo de la GFP, confiriendo así fluorescencia condicional y reversible a las moléculas de ARN que contienen la secuencia.