Modèles IN VITRO INTÉGRÉS POUR ÉTUDIER L’INFLUENCE DES CELLULES ENDOTHELIALES SUR LE TRAFIC ET LE DÉVELOPPEMENT DES CD -MÉTHODOLOGIE
Il est clair que beaucoup de travail reste à faire pour comprendre les détails moléculaires et les conséquences biologiques des interactions entre les CD et l’endothélium. L’une des limites aux progrès dans ce domaine est le manque d’utilisation généralisée des systèmes de culture endothéliale. En outre, il n’existe à ce jour aucune source d’endothélium lymphatique humain ou murin cultivé. L’identification de plusieurs marqueurs moléculaires restreignant l’endothélium lymphatique, dont la desmoplakine (Schmelz et al., 1994), le récepteur VEGF-C Flt-4 (Kaipainen et al., 1995), LYVE-1 (Banerji et al., 1999) et Prox-1 (Wigle et Oliver, 1999), devrait faciliter l’établissement d’endothélium lymphatique en culture. Nous examinons ici des méthodes quelque peu similaires et bien caractérisées qui utilisent des monocouches de HUVEC pour étudier la transmigration inverse. Un système modèle révisé qui incorpore deux monocouches endothéliales, dont une d’origine lymphatique si possible, serait le plus idéal.
Les figures 21.2 et 21.3 illustrent schématiquement deux systèmes de culture intégrés qui permettent d’étudier la migration transendothéliale apicale-basale, la différenciation et la transmigration inverse en retour à travers la même monocouche endothéliale. Les cellules endothéliales isolées à partir de veines ombilicales (Jaffe et al., 1973) et cultivées dans du sérum humain ou du sérum bovin fœtal à 20 % sans facteurs de croissance supplémentaires sont ensemencées sur une matrice amniotique humaine (Furie et al., 1984 ; Huang et al., 1988) ou une matrice de collagène de type I reconstituée (Muller et al., 1989) en un ou deux passages après l’ensemencement primaire (figure 21.2). L’ensemencement de l’endothélium sur des gels de collagène reconstitué est plus efficace si la matrice de collagène est recouverte de fibronectine juste avant l’ajout des cellules endothéliales. En revanche, la croissance de l’endothélium sur l’amnios, une matrice extracellulaire humaine native composée principalement de collagènes de type I et III (Lwebuga-Mukasa et al., 1984) et probablement d’autres composants de la matrice, ne nécessite pas l’ajout de fibronectine exogène. Ainsi, l’un des avantages de ce dernier système est qu’il est assez simple de préparer des cultures exemptes de LPS, évitant ainsi l’utilisation de sources commerciales de composants de la matrice extracellulaire, dans lesquelles les niveaux de LPS varient d’un lot à l’autre. Une autre caractéristique du modèle HUVEC/amnios est que les solutions types, comme les chimioattractants (Huang et al., 1988), ou les volumes de milieu (Randolph et Furie, 1995) qui baignent la surface basale des cultures peuvent être contrôlés ou modifiés à tout moment selon les besoins, alors que l’aspect basal des cultures utilisant du collagène reconstitué est enfermé et relativement inaccessible à la manipulation (Figure 21.2).
Pour contrebalancer ces inconvénients, le système de collagène reconstitué présente un certain nombre d’avantages, notamment une mise en place moins laborieuse et une plus grande reproductibilité entre les réplicats, puisque l’épaisseur de l’amnios peut varier quelque peu entre les réplicats. L’avantage majeur du modèle de gel de collagène reconstitué est la possibilité d’incorporer des particules dans la matrice (Figure 21.3), car les particules phagocytaires améliorent la différenciation des monocytes en DC.
Dans les deux systèmes modèles, les monocytes et autres précurseurs de DC qui sont ajoutés à l’aspect apical des cultures migrent à travers l’endothélium non stimulé (Figure 21.3). Une bonne méthode physiologiquement pertinente pour déterminer que l’endothélium est vraiment non stimulé et que le système est exempt de LPS consiste à ajouter des neutrophiles dans certains puits témoins, car ces cellules ne migrent pas à travers les monocouches endothéliales au repos, mais migrent facilement à travers l’endothélium stimulé (Huang et al, 1988 ; Furie et McHugh, 1989).
Pour étudier la transmigration inverse (figure 21.3 ; voir les méthodes dans Randolph et Furie, 1996 ; Randolph et al., 1998a, 1998b), l’endothélium doit être lavé dans le milieu après que les monocytes ont été incubés avec les monocouches pendant un temps suffisant pour permettre une transmigration maximale dans la matrice sous-jacente (1 à 2 heures). Cette étape de lavage élimine les cellules qui n’ont pas adhéré ou qui ont adhéré de façon lâche à l’endothélium pendant l’incubation. Essentiellement, toutes les cellules qui ont adhéré de façon lâche à l’endothélium migrent facilement dans la matrice sous-endothéliale (Muller et Weigl, 1992 ; Meerschaert et Furie, 1994). Typiquement, un milieu de culture complet (tel que le milieu 199) élimine efficacement les cellules non adhérentes du compartiment apical, mais une technique plus rigoureuse peut être utilisée dans laquelle l’endothélium est lavé brièvement avec un tampon sans Ca2+ et Mg2+ contenant 1 mmol/L d’EGTA pour perturber les interactions intégrine-ligand. Ensuite, le milieu de culture complet est ajouté et l’incubation se poursuit pendant des durées suffisantes pour permettre la transmigration inverse (Figure 21.4). Les deux systèmes de culture diffèrent légèrement quant au temps de demi-migration inverse : entre 24 et 36 heures dans les cultures d’amnios (Randolph et Furie, 1996) et environ 48 heures dans les cultures de collagène reconstitué (Randolph et al., 1998b). La récupération des cellules ayant subi une migration inverse (par simple pipetage à partir du compartiment apical, comme indiqué dans Randolph et al., 1998b) est plus efficace dans le modèle de gel de collagène reconstitué lorsqu’il est mis en place dans des puits de microtitration, probablement en raison d’une géométrie plus favorable. S’il est établi comme décrit, environ 15 000 cellules transmigrées inversées sont récupérées par puits de microtitration (Randolph et al., 1998a, 1998b).