Duplication translocalisée d’un segment ciblé du chromosome 2 sur le chromosome 4 et souche portant une triplication translocalisée
Nous avons précédemment construit des souches contenant des duplications chromosomiques en tandem ciblées . Le chromosome 2 de A. oryzae comprend des gènes codant pour une protéase alcaline et une alpha-amylase, ainsi que leurs gènes régulateurs respectifs prtT et amyR, qui sont importants pour la fermentation. En conséquence, les souches contenant une duplication chromosomique en tandem de 700 kb dans le chromosome 2 ont montré des activités protéase et amylase accrues dans des conditions de culture en milieu solide. Dans la présente étude, nous avons dupliqué une région de 1,4 Mb du chromosome 2 et transloqué cette région sur l’extrémité du chromosome 4 (Fig. 2). Les duplications transloquées avec succès peuvent augmenter les activités de la protéase et de l’amylase dans les cultures à l’état solide, comme l’a montré précédemment la duplication en tandem du chromosome 2. Dans des analyses ultérieures utilisant BLASTN, aucune séquence de reconnaissance I-SceI n’a été trouvée dans le chromosome de la souche RIB40 de A. oryzae. Pour transloquer la région de 1,4 Mb du chromosome 2 sur l’extrémité du chromosome 4, nous avons placé le marqueur 5′ΔpyrG (intégration ciblée de l’unité de base de 5′ΔpyrG et sélection ultérieure par l’acide 5-fluoroorotique) à côté de la région chromosomique donneuse cible. Le marqueur 3′ΔpyrG (intégration ciblée de l’unité de base de 3′ΔpyrG et sélection subséquente par le 5-FOA), qui comprenait la séquence de reconnaissance I-SceI, a été placé à côté de la région chromosomique acceptrice (figure 2, en haut). La souche parentale résultante a ensuite été utilisée pour générer une duplication transloquée de la région ciblée du chromosome 2. Pour ces procédures, des cellules protoplastes de la souche parentale ont été préparées et traitées doucement avec la méganucléase I-SceI et le PEG. Les protoplastes traités ont ensuite été incubés à 30 °C sur des plaques de milieu minimum Czapek-Dox (CZ) contenant 1,2 M de sorbitol. Après plus de 2 semaines d’incubation, nous avons observé une colonie qui s’est régénérée à partir des protoplastes traités. La fréquence du nombre de colonies régénérées était d’environ 10-8 par cellule. Pour confirmer que la duplication transloquée a été réalisée dans la souche régénérée, l’ADN génomique de la souche régénérée a été extrait et analysé par PCR en utilisant des amorces ciblant la frontière de la région transloquée (Fig. 3a).
Schéma montrant la duplication transloquée du chromosome 2 dans une souche de A. oryzae. Une région donneuse cible de 1,4 Mb du chromosome 2 a été dupliquée et transloquée vers la région acceptrice du chromosome 4 en utilisant la réplication induite par rupture
a Confirmation de la duplication translocalisée par PCR. La duplication transloquée ciblée d’une région de 1,4 Mb du chromosome 2 vers le chromosome 4 a été confirmée par PCR. Couloir 1. B-U, B-L ; Couloir 2. ct166-U, ct166-L ; Couloir 3. B-U, ct166-L ; Couloir 4. ct166-U, B-L (Couloirs 1-4. souche de duplication transloquée J4) ; Couloir 5. B-U, B-L ; Couloir 6. ct166-U, ct166-L ; Couloir 7. B-U, ct166-L ; Couloir 8. ct166-U, B-L (Couloirs 5-8. Souche de type sauvage). b Confirmation de la duplication transloquée par hybridation génomique comparative (CGH). Les barres verticales montrent les rapports des intensités de signal pour les sondes de la souche portant la duplication transloquée (J4) par rapport à celles de la souche témoin (RIB40). Les rapports des signaux d’hybridation dans la région de 1,4 Mb du chromosome 2 étaient deux fois plus élevés que ceux de l’autre région, ce qui indique que la région de 1380 Kb du chromosome 2, comprenant AO090002001035 à AO090002001558, était dupliquée. Le rapport des signaux d’hybridation dans la région de 308 kb du chromosome 4 était presque nul, indiquant que la région de 308 kb du chromosome 4, comprenant AO090166000010 à AO090166000123, a été supprimée
Nous avons détecté l’amplification du fragment d’ADN de 5 kb en utilisant des combinaisons d’amorces ciblant la position transloquée (amorces ct166-U et B-L dans la voie 4 de la Fig. 3a) et la position d’origine (amorces B-U et B-L dans la voie 1 de la Fig. 3a) dans la souche régénérée. En revanche, l’amplification du fragment de 3 kb n’a été détectée qu’en utilisant la combinaison d’amorces correspondant à la position originale (amorces B-U et B-L dans la voie 5 de la figure 3a, et amorces ct166-U et ct166-L dans la voie 6 de la figure 3a) dans la souche témoin (RIB40). Ces analyses ont confirmé que la duplication transloquée de la région chromosomique ciblée s’est produite dans la souche régénérée ; cette souche a par la suite été appelée J4 et utilisée dans les analyses ultérieures.
Comme décrit ci-dessus, la génération de multiples duplications chromosomiques transloquées est théoriquement possible. Par conséquent, nous avons construit une souche dans laquelle la région ciblée du chromosome 2 a été tripliquée, et avons évalué les effets de la triplication sur le phénotype de cette souche. Initialement, nous avons retiré le marqueur pyrG à la limite de la région de duplication transloquée du chromosome 4 par recombinaison homologue entre le chromosome et le fragment utilisé pour retirer pyrG (fichier additionnel 1 : Figure S3, haut). Les transformants ont ensuite été sélectionnés sur des plaques de sorbitol-CZ 1,2-M contenant du 5-FOA, et le vecteur d’introduction de 3′ΔpyrG avec la séquence de reconnaissance I-SceI a été intégré près de l’extrémité du chromosome 7 (fichier additionnel 1 : figure S3, région acceptrice). Cette intégration a été suivie d’une sélection à l’aide de 5-FOA. La souche parentale résultante contenant la triplication (K1-IF5-2-5FOA) a été cultivée, et des protoplastes ont été préparés pour les analyses phénotypiques. Les protoplastes ont été traités avec I-SceI et PEG comme décrit ci-dessus. Après une incubation de 3 semaines à 30 °C, les colonies régénérées ont été analysées par PCR. Après l’isolement d’une seule colonie (les détails sont décrits dans le fichier supplémentaire 1 : Fig. S4), la souche contenant des noyaux homocaryotes avec les chromosomes transloqués a été par la suite appelée souche I-8.
Confirmation des duplications chromosomiques transloquées à l’aide de l’hybridation génomique comparative en réseau (CGH en réseau)
La CGH a été utilisée pour confirmer la présence de la duplication chromosomique transloquée dans la région chromosomique ciblée. Brièvement, l’ADN génomique isolé de RIB40 (contrôle) et des souches J4 (souche Δku70 avec duplication chromosomique transloquée) a été marqué avec des colorants Cy, hybridé sur des lames de microarray à 65 °C pendant 24 h, et scanné avec un laser-scanner. La comparaison des deux souches a révélé que le rapport de signal des sondes dans la région de 1,4 Mb du chromosome 2 (AO090003001035-AO090003001558) était d’environ deux, et que celui des sondes situées dans la région de 308 Kb près de l’extrémité du chromosome 4 (AO090166000010-AO090166000123) était presque nul (Fig. 3b). Ces observations ont confirmé la présence d’une duplication transloquée de la région chromosomique ciblée dans la souche J4 (Fig. 3b et Fichier complémentaire 1 : Figure S1). La souche BN1-1 (souche ku70 + avec duplication chromosomique transloquée) a également été analysée par CGH. Des résultats similaires ont été obtenus (fichier additionnel 1 : figure S2), indiquant que la duplication transloquée de la région chromosomique ciblée s’est produite avec succès dans les souches J4 et BN1-1.
Puis, l’ADN génomique isolé des souches RIB40 (contrôle) et I-8 (souche Δku70 avec triplication chromosomique transloquée) a été marqué avec des colorants Cy, hybridé sur des lames de microarray et scanné à l’aide d’un laser-scanner. Comme le montre la figure 4, la comparaison des souches tripliquées (I-8) et des souches témoins a révélé un rapport de signal d’environ 3 pour les sondes situées dans la région de 1,4 Mb du chromosome 2 (AO090003001035-AO090003001558). De plus, les rapports de signal des sondes situées dans la région quasi-télomérique de 308 kb du chromosome 4 (AO090166000010-AO090166000123) et dans la région quasi-télomérique de 13 kb du chromosome 7 (AO090011000001-AO090011000008) étaient presque nuls, indiquant une translocation réussie du chromosome 2 à l’extrémité des chromosomes 4 et 7 dans la souche I-8 (Fig. 4). Ces résultats indiquent que de multiples duplications transloquées (comme la triplication transloquée) de la région chromosomique ciblée ont été réalisées dans la souche I-8.
Confirmation de la duplication transloquée par CGH en réseau. Les résultats de l’array CGH indiquent que la région de 1.4-Mb du chromosome 2 a été tripliquée et transloquée aux extrémités des chromosomes 4 et 7
Analyse de l’expression génique des souches de duplication et de triplication chromosomiques transloquées en culture à l’état solide
.state culture
La duplication segmentaire de grandes régions chromosomiques peut réguler à la hausse de nombreux gènes dans la région chromosomique dupliquée et provoquer des changements phénotypiques via un effet de dosage des gènes. Pour démontrer les effets de la duplication chromosomique sur l’expression des gènes, nous avons examiné les niveaux d’expression des gènes des souches dans des conditions de fermentation à l’état solide. La souche J4 avec une duplication transloquée d’une région de 1,4 Mb du chromosome 2, la souche I-8 avec une triplication transloquée de la région de 1,4 Mb du chromosome 2, et la souche RIB40 (contrôle) ont été cultivées pendant 65 h à 30 °C dans un milieu de son de blé ; ensuite, l’ARN a été extrait et analysé par des microréseaux d’expression génétique. Les ratios de gènes régulés dans les régions chromosomiques dupliquées étaient remarquablement plus élevés dans les souches à chromosomes dupliqués et tripliqués. Comme le montrent les tableaux 1 et 2, l’expression des gènes a été augmentée de 11 % dans la région chromosomique entière (1293 contre 12010). L’expression des gènes était augmentée de 37 et 64% dans les souches avec des régions dupliquées (166 vs. 446) et tripliquées (284 vs. 446), respectivement. Ces données indiquent que la duplication et la triplication segmentaires des régions chromosomiques cibles ont effectivement augmenté la transcription des gènes résidents. Ces données ont été résumées selon la classification des Clusters of Orthologous Groups (COGs) . Selon les classifications COGs, l’effet du dosage des gènes sur les mécanismes de transduction du signal (T) était faible avec des augmentations de 25 % dans les souches J4 (2 vs 8) et de 38 % dans les souches I-8 (3 vs 8). L’expression des gènes classés dans le groupe transport et métabolisme des nucléotides (F), selon la classification COGs, était significativement augmentée (5 vs. 5) dans la région dupliquée des souches (tableaux 1 et 2). En revanche, l’expression génétique était diminuée de 4 et 2,5 % dans les régions chromosomiques dupliquées (17 vs 446) et tripliquées, respectivement. Pour les chromosomes de la souche J4 (dupliquée), les sites des gènes régulés à la hausse ont été identifiés à l’aide de sondes (fichier supplémentaire 1 : figure S5), ce qui a clairement montré une transcription accrue des gènes dans la région chromosomique dupliquée. Environ 10 % des gènes situés à l’extérieur de la région dupliquée (1127 contre 11 564) étaient régulés à la hausse ; plusieurs de ces gènes étaient nettement régulés à la hausse dans la souche dupliquée (fichier supplémentaire 1 : figure S5), ce qui indique la présence de facteurs de régulation dans la région dupliquée. Les gènes régulés dans la souche J4 sont résumés dans les tableaux 3, 4, 5 et 6. Vingt-trois gènes protéolytiques, 8 gènes amylolytiques et 23 gènes xylanolytiques, qui étaient situés à l’extérieur de la région dupliquée, ont été régulés à la hausse. L’expression accrue des gènes protéolytiques, situés en dehors de la région dupliquée, a été observée dans la souche J4, ce qui suggère que l’effet de dosage des gènes exercé par prtT s’est produit dans la région dupliquée. De même, l’expression régulée à la hausse des gènes amylolytiques indique que l’effet de dosage des gènes, exercé par amyR, se produit dans la région dupliquée. L’expression de xlnR n’a pas été augmentée. Cependant, nous avons observé une expression régulée de gènes liés à la xylanase, dont la plupart étaient régulés positivement par xlnR . Cela indique que xlnR2 (AO090003001292) a affecté l’expression de ces gènes. L’expression de prtT, amyR, et xlnR2 était régulée à la hausse dans la région dupliquée (Tableau 6). En revanche, 1252 gènes situés en dehors de la région dupliquée ont été régulés à la baisse dans la souche J4, ce qui indique que les gènes impliqués dans la régulation négative étaient également présents dans la région dupliquée.
Activité enzymatique dans les souches de duplication et de triplication chromosomiques transloquées en culture à l’état solide
Pour examiner comment la duplication et la triplication chromosomiques affectent les phénotypes, nous avons évalué l’activité enzymatique des souches de duplication chromosomique transloquées dans des conditions de culture à l’état solide. Nous avons précédemment montré une augmentation de l’activité de la protéase, de l’amylase et de la carboxypeptidase acide dans les souches avec la région de 700 kb (AO090003001003-AO090003001258) de la duplication en tandem du chromosome 2 dans des conditions de culture à l’état solide sur un milieu de son de blé. Nous avons donc mesuré les activités de ces enzymes dans les souches de duplication transloquées dans des conditions de culture en milieu solide (Fig. 5a). Les duplications chromosomiques transloquées (J4) et en tandem (700k-dup) ont toutes deux entraîné une augmentation de l’activité de la protéase et de l’amylase. De plus, l’activité de la carboxypeptidase acide dans la souche de duplication transloquée a montré des niveaux légèrement plus élevés que ceux de la souche de type sauvage (contrôle RIB40), mais des niveaux plus faibles que ceux de la souche de duplication en tandem. Une liste des gènes situés dans la région de chevauchement entre J4 et 700k-dup est fournie dans le fichier supplémentaire 1 : tableau S2. Nous avons ensuite examiné l’activité enzymatique dans la souche de triplication I-8 dans des conditions de culture à l’état solide. L’activité protéasique a été multipliée par plus de quatre dans la souche de triplication (I-8) par rapport à celle de la souche témoin (RIB40), et était supérieure à celles des souches de translocation et de duplication en tandem (J4 et 700k-dup) (Fig. 5a). L’activité de l’amylase était également plus élevée dans la souche de triplication (I-8) que dans les souches de duplication (J4 et 700k-dup), ce qui indique que le dosage des gènes a montré des effets phénotypiques accrus après la duplication multiple de la région chromosomique. La souche BP-B3, une souche de duplication en tandem portant une région de 9 kb (AO090003001033-AO090003001036) incluant alp (gène codant pour la protéase alcaline, AO090003001036), a montré une activité protéasique 1,7 fois supérieure à celle de la souche témoin (Fig. 5a). L’expression d’alp et de prtT dans les souches de duplication a été examinée par PCR en temps réel (Tableau 7).
Phénotypes des souches de duplication transloquées. a Activité enzymatique dans les souches portant une duplication chromosomique dans des conditions de culture à l’état solide. Activité protéase totale, alpha-amylase et carboxypeptidase acide dans des cultures à l’état solide ; RIB40 (contrôle), J4 (la souche portant la duplication transloquée du chromosome 2), I-8 (la souche portant la triplication transloquée du chromosome 2), APRT (souche de surexpression de prtT), 1546K-APRT (la souche portant la duplication transloquée du chromosome 2 avec surexpression de prtT), TLTA-APRT (la souche portant la triplication transloquée du chromosome 2 avec surexpression de prtT), Ao-700k-dup (la souche portant la duplication en tandem d’une région de 700 kb du chromosome 2), BP-B3 (la souche portant la duplication en tandem d’une région de 9 kb du chromosome 2). b Phénotypes de croissance des souches portant une duplication chromosomique cultivées sur des plaques CZ. Les souches ont été inoculées sur des plaques CZ 1.2 M de sorbitol et incubées à 30 °C pendant 7 jours
Nous avons ensuite surexprimé le facteur de transcription prtT et examiné ses effets dans des souches à translocation chromosomique dupliquée et tripliquée. PrtT régule les enzymes protéolytiques chez A. oryzae . Nos microréseaux d’expression génique ont révélé une multiplication modérée par cinq de l’expression de prtT dans les souches dupliquées. Ces données suggèrent que prtT limite la vitesse, ce qui indique une activité protéasique accrue dans les souches surexprimant prtT. Le vecteur de surexpression prtT pAPRT contient un promoteur et un terminateur amyB, reliés au cadre de lecture ouvert du gène prtT, et un marqueur pyrG. pAPRT à l’état circulaire a été utilisé pour transformer la souche RP1 (souche à délétion pyrG), la souche del 1546K4 (souche à délétion pyrG dérivée de la souche J4), et la souche TLTAs11B (souche à délétion pyrG dérivée de la souche I-8). Des transformants uniques présentant de grands halos clairs sur les plaques de caséine, ce qui indique une activité protéase élevée , ont été sélectionnés pour chaque souche de surexpression de prtT ; la surexpression de prtT a été confirmée par PCR en temps réel (tableau 8).
L’expression de prtT a été multipliée par plus de 10 dans l’APRT, 1546 K-APRT, et TLTA-APRT par rapport à celle de la souche témoin (Tableau 8). En conséquence, l’activité de la protéase dans les cultures à l’état solide (Fig. 5a) était environ trois fois plus élevée dans la souche APRT-transformée que dans la souche RIB40 (type sauvage). Cela indique qu’une seule copie de l’alp limitait le taux d’activité de la protéase dans des conditions de surexpression de prtT. De plus, l’activité protéase était similaire dans les souches 1546 K-APRT et TLTA-APRT et près de six fois supérieure à celle de la souche RIB40 ; cela indique que deux copies d’alp étaient suffisantes pour l’activité protéase lorsque prtT était surexprimé.
Les souches APRT, 1546 K-APRT et TLTA-APRT ont montré des augmentations similaires de l’activité de la carboxypeptidase acide par rapport à celle de la souche RIB40. Ceci suggère que les gènes de la carboxypeptidase acide sont transactivés par prtT, mais ne sont pas situés dans la région chromosomique dupliquée. L’intégration à copie unique de pAPRT dans les souches APRT et TLTA-APRT, et l’intégration à deux copies de pAPRT dans la souche 1546 K-APRT, ont été confirmées par PCR quantitative (fichier supplémentaire 1 : figure S7).
Les phénotypes de croissance des souches de duplication transloquées sur des plaques CZ sont présentés dans la figure 5b. Les souches ont été cultivées sur des plaques de sorbitol-CZ 1,2 M à 30 °C pendant 7 jours. La souche J4 a montré un léger retard de croissance par rapport à la croissance de la souche RIB40. La souche I-8 a montré un léger retard de croissance par rapport à la souche J4. Le taux de croissance des souches a progressivement diminué à mesure que le nombre de copies de la région dupliquée du chromosome 2 augmentait. La délétion d’une région de 308 kb du chromosome 4, résultant d’une translocation dans les souches J4 et I-8, peut avoir causé le retard de croissance. Les taux de croissance des souches APRT et 1546 K-APRT étaient similaires à ceux des souches RIB40 et J4, respectivement. Cependant, la souche TLTA-APRT a montré un retard de croissance important par rapport à la souche I-8. Comme le montre le tableau 8, l’expression d’alp était extrêmement élevée dans la souche TLTA-APRT par rapport à celle des souches APRT ou 1546 K-APRT. L’expression d’alp était initialement élevée dans la souche témoin (RIB40), ce qui suggère que l’augmentation de l’expression d’alp a provoqué des retards de croissance dans la souche TLTA-APRT.