La PCR quantitative en temps réel, ou qPCR, est une méthode standard pour détecter et quantifier une séquence cible spécifique, ou quantifier les niveaux d’expression des gènes dans un échantillon. Dans la qPCR, des sondes ou des acides nucléiques marqués par fluorescence, ou des colorants fluorescents se liant à l’ADN double brin sont incorporés dans la réaction PCR et la formation du produit est surveillée en temps réel après chaque cycle PCR.
La qPCR à base de sonde utilise une amorce ou une sonde fluorescente pour détecter le produit d’amplification. Un avantage de cette méthode est qu’elle permet une détection spécifique de la séquence de la cible et réduit la probabilité de détecter des artefacts non spécifiques. La détection par sonde peut également s’adapter à l’amplification multiplex en utilisant des sondes marquées différemment. Il existe plusieurs approches différentes de la détection par qPCR à base de sondes, notamment les sondes d’hydrolyse telles que TaqMan®, les sondes d’hybridation, les sondes en épingle à cheveux et les amorces marquées.
L’utilisation de colorants fluorescents se liant à l’ADN, comme le vert BRYT® ou le vert SYBR®, est l’une des approches de qPCR les plus simples. Un colorant est ajouté à la réaction, et la fluorescence est mesurée à chaque cycle de PCR. Comme la fluorescence de ces colorants augmente considérablement en présence d’ADN double brin, la synthèse de l’ADN peut être suivie comme une augmentation du signal fluorescent.
Le principal résultat d’une expérience de PCR en temps réel est une courbe d’amplification montrant l’accumulation du produit amplifié sous forme de signal fluorescent en fonction du nombre de cycles.
La quantification de la quantité de matériau de départ se fait à l’aide du cycle de quantification (Cq, également appelé Ct). Cq ou Ct (cycle seuil) est le cycle d’amplification auquel le signal de fluorescence détecté atteint un seuil d’amplification dans un puits spécifique. Le seuil d’amplification est calculé sur la base de la fluorescence de fond sur la région de la ligne de base de toutes les courbes du groupe et représente le point où le signal du rapporteur est significativement plus élevé que les niveaux de fond. Cq est inversement lié à la quantité de matrice de départ dans la réaction et constitue une mesure relative de la concentration de la cible dans la réaction PCR.