MODELLI IN VITRO INTEGRATI PER STUDERE L’INFLUENZA DELLE CELLULE ENDOTELIALI SUL TRAFFICO DEI DC E LO SVILUPPO -METODOLOGIA
Chiaramente, molto lavoro è ancora necessario per comprendere i dettagli molecolari e le conseguenze biologiche delle interazioni tra DC ed endotelio. Una limitazione al progresso in questo campo è la mancanza di un uso diffuso di sistemi di coltura endoteliale. Inoltre, finora non esiste una fonte di endotelio linfatico umano o murino in coltura. L’identificazione di diversi marcatori molecolari limitati all’endotelio linfatico, tra cui la desmoplakin (Schmelz et al., 1994), il recettore VEGF-C Flt-4 (Kaipainen et al., 1995), LYVE-1 (Banerji et al., 1999) e Prox-1 (Wigle e Oliver, 1999), dovrebbe facilitare la creazione di endotelio linfatico coltivato. Qui vengono discussi metodi alquanto simili e ben caratterizzati che utilizzano i monostrati HUVEC per studiare la trasmigrazione inversa. Un sistema modello rivisto che incorpora due monostrati endoteliali, uno di origine linfatica, se possibile, sarebbe più ideale.
Le figure 21.2 e 21.3 illustrano schematicamente due sistemi di coltura integrati che permettono lo studio della migrazione transendoteliale apicale-basale, la differenziazione e la trasmigrazione inversa attraverso lo stesso monostrato endoteliale. Le cellule endoteliali isolate dalle vene ombelicali (Jaffe et al., 1973) e coltivate in 20% di siero umano o siero fetale bovino senza fattori di crescita aggiuntivi sono seminate su matrice amniotica umana (Furie et al., 1984; Huang et al., 1988) o una matrice ricostituita collagene di tipo I (Muller et al., 1989) entro uno o due passaggi dalla placcatura primaria (Figura 21.2). La semina dell’endotelio su gel di collagene ricostituito è più efficiente se la matrice di collagene è rivestita di fibronectina appena prima dell’aggiunta delle cellule endoteliali. Al contrario, la crescita dell’endotelio sull’amnion, una matrice extracellulare umana nativa composta prevalentemente da collageni di tipo I e III (Lwebuga-Mukasa et al., 1984) e probabilmente altri componenti della matrice, non richiede l’aggiunta di fibronectina esogena. Quindi, un vantaggio di quest’ultimo sistema è che è abbastanza semplice preparare colture senza LPS, evitando l’uso di fonti commerciali di componenti della matrice extracellulare, in cui i livelli di LPS variano da lotto a lotto. Un’altra caratteristica del modello HUVEC/amnion è che le soluzioni tipo, come chemoattrattanti (Huang et al., 1988), o volumi di mezzo (Randolph e Furie, 1995) che bagnano la superficie basale delle culture può essere controllato o modificato in qualsiasi momento come desiderato, mentre l’aspetto basale delle culture utilizzando collagene ricostituito è racchiuso e relativamente inaccessibile alla manipolazione (Figura 21.2).
Pesando contro questi svantaggi, il sistema collagene ricostituito ha una serie di vantaggi, tra cui meno laborioso set-up e una maggiore riproducibilità tra repliche, poiché lo spessore del amnion può variare un po ‘tra repliche. Il vantaggio principale del modello di gel di collagene ricostituito è la possibilità di incorporare particelle nella matrice (Figura 21.3), dal momento che le particelle fagocitanti migliorano la differenziazione dei monociti in DCs.
In entrambi i sistemi modello, i monociti e altri precursori DC che vengono aggiunti all’aspetto apicale delle culture migrano attraverso l’endotelio non stimolato (Figura 21.3). Un buon metodo fisiologicamente rilevante per determinare che l’endotelio è veramente non stimolato e che il sistema è LPS-free è quello di aggiungere neutrofili ad alcuni pozzetti di controllo, come queste cellule non migrano attraverso monostrati endoteliali a riposo, ma facilmente migrare attraverso l’endotelio stimolato (Huang et al, 1988; Furie e McHugh, 1989).
Per studiare la trasmigrazione inversa (Figura 21.3; vedi metodi in Randolph e Furie, 1996; Randolph et al., 1998a, 1998b), l’endotelio deve essere lavato in mezzo dopo che i monociti sono stati incubati con i monostrati per un tempo sufficiente a consentire la massima trasmigrazione nella matrice sottostante (1-2 ore). Questa fase di lavaggio rimuove le cellule che non sono riuscite ad aderire o hanno aderito debolmente all’endotelio durante l’incubazione. Essenzialmente tutte le cellule che hanno aderito strettamente all’endotelio migrano facilmente nella matrice subendoteliale (Muller e Weigl, 1992; Meerschaert e Furie, 1994). In genere, il mezzo di coltura completo (come Medium 199) rimuove efficacemente le cellule non aderenti dal compartimento apicale, ma una tecnica più rigorosa può essere utilizzata in cui l’endotelio viene lavato brevemente con Ca2 + e Mg2 + buffer contenente 1 mmol/L EGTA per interrompere le interazioni integrina-ligando. Poi, il mezzo di coltura completo viene aggiunto e l’incubazione continua per una durata sufficiente a consentire la trasmigrazione inversa (Figura 21.4). I due sistemi di coltura differiscono leggermente nell’intervallo di tempo della trasmigrazione inversa: tra le 24 e le 36 ore nelle colture di amnion (Randolph e Furie, 1996) e circa 48 ore nelle colture di collagene ricostituito (Randolph et al., 1998b). Il recupero delle cellule trasmigrate all’inverso (tramite semplice pipettaggio dal compartimento apicale come descritto in Randolph et al., 1998b) è più efficiente nel modello di gel di collagene ricostituito quando è impostato in pozzetti per microtitolazione, probabilmente a causa di una geometria più favorevole. Se stabilito come descritto, vengono recuperate circa 15 000 cellule trasmigrate all’inverso per pozzetto di microtitolazione (Randolph et al., 1998a, 1998b).