Duplicazione traslocata di un segmento mirato del cromosoma 2 sul cromosoma 4 e un ceppo con triplicazione traslocata
Abbiamo precedentemente costruito ceppi contenenti duplicazioni cromosomiche tandem mirate. Il cromosoma 2 di A. oryzae include i geni che codificano la proteasi alcalina e l’alfa-amilasi, e i loro rispettivi geni regolatori prtT e amyR, che sono importanti per la fermentazione. Di conseguenza, i ceppi che contengono una duplicazione cromosomica in tandem di 700 kb nel cromosoma 2 hanno mostrato un aumento delle attività di proteasi e amilasi in condizioni di coltura allo stato solido. Nel presente studio, abbiamo duplicato una regione 1.4-Mb del cromosoma 2 e traslocato questa regione sulla fine del cromosoma 4 (Fig. 2). Le duplicazioni traslocate con successo possono aumentare le attività della proteasi e dell’amilasi nelle culture a stato solido, come dimostrato in precedenza dalla duplicazione in tandem del cromosoma 2. Nelle analisi successive utilizzando BLASTN, nessuna sequenza di riconoscimento I-SceI è stato trovato nel cromosoma di A. oryzae ceppo RIB40. Per traslocare la regione di 1,4 Mb del cromosoma 2 sull’estremità del cromosoma 4, abbiamo posizionato il marcatore 5′ΔpyrG (integrazione mirata dell’unità di base del 5′ΔpyrG e successiva selezione dell’acido 5-fluorotico) adiacente alla regione cromosomica target del donatore. Il marcatore 3′ΔpyrG (integrazione mirata dell’unità di base del 3′ΔpyrG e successiva selezione 5-FOA), che includeva la sequenza di riconoscimento I-SceI, è stato posizionato adiacente alla regione cromosomica dell’accettore (Fig. 2, in alto). Il ceppo parentale risultante è stato quindi utilizzato per generare la duplicazione traslocata della regione mirata del cromosoma 2. Per queste procedure, le cellule del protoplasto del ceppo parentale sono state preparate e trattate delicatamente con meganucleasi I-SceI e PEG. I protoplasti trattati sono stati poi incubati a 30 °C su piastre Czapek-Dox minimum medium (CZ) contenenti 1,2 M sorbitolo. Dopo più di 2 settimane di incubazione, abbiamo osservato una colonia rigenerata dai protoplasti trattati. La frequenza del numero di colonie rigenerate era di circa 10-8 per cellula. Per confermare che la duplicazione traslocata è stata ottenuta nel ceppo rigenerato, il DNA genomico del ceppo rigenerato è stato estratto e analizzato mediante PCR utilizzando primer che mirano al confine della regione traslocata (Fig. 3a).
Schema della duplicazione traslocata del cromosoma 2 in un ceppo di A. oryzae. Una regione donatrice di 1,4 Mb del cromosoma 2 è stata duplicata e traslocata nella regione accettore del cromosoma 4 utilizzando la replicazione indotta dalla rottura
a Conferma della duplicazione traslocata tramite PCR. La duplicazione traslata mirata di una regione di 1,4 Mb del cromosoma 2 al cromosoma 4 è stata confermata dalla PCR. Corsia 1. B-U, B-L; Corsia 2. ct166-U, ct166-L; Corsia 3. B-U, ct166-L; Corsia 4. ct166-U, B-L (corsie 1-4. ceppo di duplicazione traslocato J4); Corsia 5. B-U, B-L; Corsia 6. ct166-U, ct166-L; Corsia 7. B-U, ct166-L; Corsia 8. ct166-U, B-L (corsie 5-8. ceppo wild-type). b Conferma della duplicazione traslocata mediante ibridazione comparativa del genoma (CGH). Le barre verticali mostrano i rapporti di intensità del segnale per le sonde del ceppo che porta la duplicazione traslocata (J4) rispetto a quelle del ceppo di controllo (RIB40). I rapporti dei segnali di ibridazione nella regione di 1,4 Mb del cromosoma 2 erano doppi rispetto a quelli dell’altra regione, indicando che la regione di 1380 Kb del cromosoma 2, che include da AO090002001035 a AO090002001558, era duplicata. Il rapporto dei segnali di ibridazione nella regione di 308 kb del cromosoma 4 era quasi nullo, indicando che la regione di 308 kb del cromosoma 4, compresa da AO090166000010 a AO090166000123, è stata eliminata
Abbiamo rilevato l’amplificazione del frammento di DNA di 5 kb usando combinazioni di primer che puntavano alla posizione traslocata (primer ct166-U e B-L nella corsia 4 della Fig. 3a) e la posizione originale (primer B-U e B-L nella corsia 1 della Fig. 3a) nel ceppo rigenerato. Al contrario, l’amplificazione del frammento di 3 kb è stata rilevata solo utilizzando la combinazione di primer corrispondente alla posizione originale (primer B-U e B-L nella corsia 5 della Fig. 3a, e primer ct166-U e ct166-L nella corsia 6 della Fig. 3a) nel ceppo di controllo (RIB40). Queste analisi hanno confermato che la duplicazione traslocata della regione cromosomica mirata si è verificata nel ceppo rigenerato; questo ceppo è stato poi indicato come J4 e utilizzato in ulteriori analisi.
Come descritto sopra, la generazione di duplicazioni cromosomiche multiple traslocate è teoricamente possibile. Pertanto, abbiamo costruito un ceppo in cui la regione mirata del cromosoma 2 è stata triplicata e abbiamo valutato gli effetti della triplicazione sul fenotipo di questo ceppo. Inizialmente, abbiamo rimosso il marcatore pyrG al confine della regione di duplicazione traslocata del cromosoma 4 mediante ricombinazione omologa tra il cromosoma e il frammento utilizzato per rimuovere pyrG (file aggiuntivo 1: Figura S3, in alto). I trasformanti sono stati poi selezionati su piastre 1.2-M sorbitolo-CZ contenenti 5-FOA, e il vettore per l’introduzione del 3′ΔpyrG con la sequenza di riconoscimento I-SceI è stato integrato vicino alla fine del cromosoma 7 (file aggiuntivo 1: Figura S3, regione accettante). Questo è stato seguito dalla selezione con 5-FOA. Il ceppo parentale contenente la triplicazione risultante (K1-IF5-2-5FOA) è stato coltivato, e i protoplasti sono stati preparati per le analisi fenotipiche. I protoplasti sono stati trattati con I-SceI e PEG come descritto sopra. Dopo l’incubazione per 3 settimane a 30 °C, le colonie rigenerate sono state analizzate mediante PCR. Dopo l’isolamento di una singola colonia (i dettagli sono descritti nel file aggiuntivo 1: Fig. S4), il ceppo contenente nuclei omocarioti con i cromosomi traslocati è stato successivamente indicato come ceppo I-8.
Conferma delle duplicazioni cromosomiche traslocate utilizzando l’ibridazione comparativa del genoma (array CGH)
CGH è stato utilizzato per confermare la presenza di duplicazione cromosomica traslocata nella regione cromosomica mirata. In breve, il DNA genomico isolato dai ceppi RIB40 (controllo) e J4 (ceppo Δku70 con duplicazione cromosomica traslocata) è stato marcato con coloranti Cy, ibridato su vetrini microarray a 65 °C per 24 ore, e scansionato con uno scanner laser. Confronto dei due ceppi ha rivelato che il rapporto di segnale delle sonde nella regione 1.4-Mb del cromosoma 2 (AO090003001035-AO090003001558) era circa due, e quella delle sonde situate nella regione 308-kb vicino alla fine terminale del cromosoma 4 (AO090166000010-AO090166000123) era quasi zero (Fig. 3b). Queste osservazioni hanno confermato la presenza di duplicazione traslocata della regione cromosomica mirata nel ceppo J4 (Fig. 3b e file aggiuntivo 1: Figura S1). Il ceppo BN1-1 (ku70 + ceppo con duplicazione cromosomica traslocata) è stato anche analizzato utilizzando CGH. Risultati simili sono stati ottenuti (Additional file 1: Figura S2), indicando che la duplicazione traslocata della regione cromosomica mirata si è verificata con successo nei ceppi J4 e BN1-1.
In seguito, il DNA genomico isolato da RIB40 (controllo) e ceppi I-8 (ceppo Δku70 con triplicazione cromosomica traslocata) è stato marcato con coloranti Cy, ibridato su vetrini microarray, e scansionato utilizzando un laser-scanner. Come mostrato in Fig. 4, i confronti tra i ceppi triplicati (I-8) e quelli di controllo hanno rivelato un rapporto di segnale di circa 3 per le sonde situate nella regione di 1,4 Mb del cromosoma 2 (AO090003001035-AO090003001558). Inoltre, i rapporti di segnale delle sonde situate nella regione quasi-telomerica di 308 kb del cromosoma 4 (AO090166000010-AO090166000123) e nella regione quasi-telomerica di 13 kb del cromosoma 7 (AO090011000001-AO090011000008) erano quasi zero, indicando una traslocazione riuscita del cromosoma 2 alla fine dei cromosomi 4 e 7 nel ceppo I-8 (Fig. 4). Questi risultati indicano che nel ceppo I-8 sono state ottenute duplicazioni multiple traslocate (come la triplicazione traslocata) della regione cromosomica mirata.
Conferma della duplicazione traslocata tramite array CGH. I risultati dell’array CGH indicano che la regione di 1.4-Mb del cromosoma 2 è stato triplicato e traslocato alle estremità dei cromosomi 4 e 7
Analisi dell’espressione genica di ceppi di duplicazione e triplicazione cromosomica traslata in coltura allo stato solido
La duplicazione segmentaria di grandi regioni cromosomiche può upregolare numerosi geni nella regione cromosomica duplicata e causare cambiamenti fenotipici attraverso l’effetto del dosaggio genico. Per dimostrare gli effetti della duplicazione cromosomica sull’espressione genica, abbiamo esaminato i livelli di espressione genica dei ceppi in condizioni di fermentazione allo stato solido. Il ceppo J4 con una duplicazione traslocata di una regione di 1,4 Mb del cromosoma 2, il ceppo I-8 con una triplicazione traslocata della regione di 1,4 Mb del cromosoma 2 e il ceppo RIB40 (controllo) sono stati coltivati per 65 ore a 30 °C in un terreno di crusca di grano; poi l’RNA è stato estratto e analizzato con microarray di espressione genica. I rapporti dei geni upregolati nelle regioni cromosomiche duplicate erano notevolmente più alti nei ceppi con cromosomi duplicati e triplicati. Come mostrato nelle tabelle 1 e 2, l’espressione genica era aumentata dell’11% nell’intera regione cromosomica (1293 contro 12010). L’espressione genica era aumentata del 37 e del 64% nei ceppi con regioni duplicate (166 vs. 446) e triplicate (284 vs. 446), rispettivamente. Questi dati indicano che la duplicazione segmentale e la triplicazione delle regioni cromosomiche bersaglio hanno effettivamente aumentato la trascrizione dei geni residenti. Questi dati sono stati riassunti secondo la classificazione Clusters of Orthologous Groups (COGs). Per le classificazioni COGs, l’effetto del dosaggio dei geni sui meccanismi di trasduzione del segnale (T) era basso con aumenti del 25% nei ceppi J4 (2 contro 8) e del 38% nei ceppi I-8 (3 contro 8). L’espressione dei geni classificati nel gruppo di trasporto e metabolismo dei nucleotidi (F), secondo la classificazione COGs, era significativamente aumentata (5 vs. 5) nella regione duplicata dei ceppi (Tabelle 1 e 2). Al contrario, l’espressione genica era diminuita del 4 e del 2,5% nelle regioni cromosomiche duplicate (17 vs. 446) e triplicate, rispettivamente. Per i cromosomi nel ceppo J4 (duplicato), i siti di geni upregolati sono stati identificati utilizzando le sonde (file aggiuntivo 1: Figura S5), che hanno chiaramente mostrato una maggiore trascrizione genica nella regione cromosomica duplicata. Circa il 10% dei geni situati al di fuori della regione duplicata (1127 vs. 11.564) sono stati upregolati; molti di questi geni sono stati marcatamente upregolati nel ceppo duplicato (Additional file 1: Figura S5), indicando la presenza di fattori di regolazione nella regione duplicata. I geni upregolati nel ceppo J4 sono riassunti nelle tabelle 3, 4, 5 e 6. Ventitré geni proteolitici, 8 geni amilolitici e 23 geni xilanolitici, che erano situati al di fuori della regione duplicata, sono stati upregolati. L’aumento dell’espressione dei geni proteolitici, situati al di fuori della regione duplicata, è stato osservato nel ceppo J4, suggerendo che l’effetto di dosaggio genico esercitato da prtT si è verificato nella regione duplicata. Allo stesso modo, l’espressione upregolata dei geni amilolitici indicava che l’effetto di dosaggio genico, esercitato da amyR, si verificava nella regione duplicata. L’espressione di xlnR non è stata aumentata. Tuttavia, abbiamo osservato l’espressione upregolata dei geni legati alla xilanasi, la maggior parte dei quali erano regolati positivamente da xlnR . Questo indica che xlnR2 (AO090003001292) ha influenzato l’espressione di questi geni. L’espressione di prtT, amyR e xlnR2 è stata upregolata nella regione duplicata (Tabella 6). Al contrario, 1252 geni situati al di fuori della regione duplicata sono stati downregolati nel ceppo J4, indicando che i geni coinvolti nella regolazione negativa erano presenti anche nella regione duplicata.
Attività enzimatica in ceppi di duplicazione e triplicazione cromosomica traslocata in coltura allo stato solido
Per esaminare come la duplicazione e la triplicazione cromosomica influenzino i fenotipi, abbiamo valutato l’attività enzimatica nei ceppi di duplicazione cromosomica traslocata in condizioni di stato solido. Abbiamo precedentemente dimostrato un aumento dell’attività della proteasi, dell’amilasi e della carbossipeptidasi acida nei ceppi con la regione 700-kb (AO090003001003-AO090003001258) della duplicazione tandem del cromosoma 2 in condizioni di coltivazione allo stato solido su mezzi di crusca di grano. Pertanto, abbiamo misurato le attività di questi enzimi nei ceppi di duplicazione traslocati in condizioni di coltura allo stato solido (Fig. 5a). Entrambe le duplicazioni cromosomiche traslocate (J4) e tandem (700k-dup) hanno portato ad un aumento dell’attività della proteasi e dell’amilasi. Inoltre, l’attività della carbossipeptidasi acida nel ceppo di duplicazione traslocato ha mostrato livelli leggermente superiori a quelli del ceppo wild-type (controllo RIB40), ma livelli inferiori a quelli del ceppo di duplicazione tandem. Un elenco di geni situati nella regione sovrapposta tra J4 e 700k-dup è fornito nel file aggiuntivo 1: Tabella S2. Abbiamo poi esaminato l’attività enzimatica nel ceppo di triplicazione I-8 in condizioni di coltura allo stato solido. L’attività della proteasi è stata aumentata di più di quattro volte nel ceppo di triplicazione (I-8) rispetto a quella del ceppo di controllo (RIB40), ed era superiore a quella dei ceppi traslocati e di duplicazione tandem (J4 e 700k-dup) (Fig. 5a). L’attività dell’amilasi era anche più alta nel ceppo triplicato (I-8) rispetto ai ceppi duplicati (J4 e 700k-dup), indicando che il dosaggio genico ha mostrato maggiori effetti fenotipici dopo la duplicazione multipla della regione cromosomica. Il ceppo BP-B3, un ceppo di duplicazione in tandem con una regione di 9 kb (AO090003001033-AO090003001036) che includeva alp (gene che codifica la proteasi alcalina, AO090003001036), ha mostrato un aumento di 1,7 volte dell’attività proteasica rispetto a quella del ceppo di controllo (Fig. 5a). L’espressione di alp e prtT nei ceppi duplicati è stata esaminata mediante PCR in tempo reale (Tabella 7).
Fenotipi di ceppi duplicati traslocati. a Attività enzimatica in ceppi con duplicazione cromosomica in condizioni di coltura allo stato solido. Attività totale di proteasi, alfa-amilasi e carbossipeptidasi acida in colture allo stato solido; RIB40 (controllo), J4 (il ceppo che porta la duplicazione traslocata del cromosoma 2), I-8 (il ceppo che porta la triplicazione traslocata del cromosoma 2), APRT (ceppo con sovraespressione di prtT), 1546K-APRT (il ceppo che porta la duplicazione traslocata del cromosoma 2 con sovraespressione di prtT), TLTA-APRT (il ceppo con triplicazione traslocata del cromosoma 2 con sovraespressione di prtT), Ao-700k-dup (il ceppo con duplicazione in tandem di una regione di 700 kb del cromosoma 2), BP-B3 (il ceppo con duplicazione in tandem di una regione di 9 kb del cromosoma 2). b Fenotipi di crescita dei ceppi con duplicazione cromosomica coltivati su piastre CZ. I ceppi sono stati inoculati su piastre CZ 1.2 M sorbitolo su piastre CZ e incubati a 30 °C per 7 giorni
Abbiamo poi sovraespresso il fattore di trascrizione prtT ed esaminato i suoi effetti nei ceppi con duplicazione e tripla traslocazione cromosomica. PrtT regola gli enzimi proteolitici in A. oryzae. I nostri microarray di espressione genica hanno rivelato moderati aumenti di cinque volte nell’espressione di prtT nei ceppi di duplicazione. Questi dati suggeriscono che prtT è limitante, indicando una maggiore attività proteasica nei ceppi che sovraesprimono prtT. Il vettore di sovraespressione prtT pAPRT contiene un promotore e un terminatore amyB, collegato all’open reading frame del gene prtT, e un marcatore pyrG. pAPRT in stato circolare è stato usato per trasformare il ceppo RP1 (ceppo di delezione pyrG), il ceppo del 1546K4 (ceppo di delezione pyrG derivato dal ceppo J4), e il ceppo TLTAs11B (ceppo di delezione pyrG derivato dal ceppo I-8). Singoli trasformanti che mostrano grandi aloni chiari sulle piastre di caseina, che indicano un’elevata attività proteasica, sono stati selezionati per ogni ceppo di sovraespressione di prtT; la sovraespressione di prtT è stata confermata dalla PCR in tempo reale (Tabella 8).
L’espressione di prtT è stata aumentata di oltre 10 volte nella APRT, 1546 K-APRT, e TLTA-APRT rispetto al ceppo di controllo (Tabella 8). Di conseguenza, l’attività della proteasi nelle colture allo stato solido (Fig. 5a) era circa tre volte superiore nel ceppo trasformato da APRT rispetto al ceppo RIB40 (wild type). Questo indica che una singola copia di alp era limitante per l’attività della proteasi in condizioni di sovraespressione di prtT. Inoltre, l’attività della proteasi era simile nei ceppi 1546 K-APRT e TLTA-APRT e quasi sei volte superiore a quella del ceppo RIB40; questo indica che due copie di alp erano sufficienti per l’attività della proteasi quando prtT era sovraespresso.
I ceppi APRT, 1546 K-APRT, e TLTA-APRT hanno mostrato un aumento simile dell’attività della carbossipeptidasi acida rispetto a quella del ceppo RIB40. Questo suggerisce che i geni della carbossipeptidasi acida sono transattivati da prtT, ma non sono localizzati nella regione cromosomica duplicata. L’integrazione a copia singola di pAPRT nei ceppi APRT e TLTA-APRT, e l’integrazione a copia doppia di pAPRT nel ceppo 1546 K-APRT, sono state confermate dalla PCR quantitativa (Additional file 1: Figura S7).
I fenotipi di crescita dei ceppi duplicati traslocati su piastre CZ sono presentati in Fig. 5b. I ceppi sono stati coltivati su piastre 1,2 M sorbitolo-CZ a 30 °C per 7 giorni. Il ceppo J4 ha mostrato un leggero ritardo nella crescita rispetto alla crescita del ceppo RIB40. Il ceppo I-8 ha mostrato un leggero ritardo nella crescita rispetto a quello del ceppo J4. Il tasso di crescita dei ceppi è diminuito gradualmente all’aumentare del numero di copie della regione duplicata dal cromosoma 2. La delezione di una regione di 308 kb dal cromosoma 4, risultante dalla traslocazione nei ceppi J4 e I-8, potrebbe aver causato il ritardo nella crescita. I tassi di crescita dei ceppi APRT e 1546 K-APRT erano simili a quelli dei ceppi RIB40 e J4, rispettivamente. Tuttavia, il ceppo TLTA-APRT ha mostrato un grave ritardo nella crescita rispetto a quello del ceppo I-8. Come mostrato nella Tabella 8, l’espressione di alp era estremamente elevata nel ceppo TLTA-APRT rispetto a quella dei ceppi APRT o 1546 K-APRT. L’espressione di alp era originariamente alta nel ceppo di controllo (RIB40), suggerendo che l’aumento dell’espressione di alp ha causato ritardi nella crescita nel ceppo TLTA-APRT.