Un promotore U6 (mU6) del topo espande i siti di targeting genomico
Una progettazione ottimale della libreria gRNA richiede un gran numero di siti target genomici accessibili. La trascrizione del gRNA è comunemente guidata dal promotore umano U6 (hU6) che si ritiene richieda guanina (G) come primo nucleotide del suo trascritto1,2,3. Nel caso in cui il primo nucleotide non è una G, è possibile sostituire il primo nucleotide con una G o aggiungere un extra G all’estremità 5′ di gRNA, con conseguente gRNA-DNA mismatch alla fine 5′. WT-SpCas9 può tollerare gRNA-DNA mismatch all’estremità 5′, così può bersaglio qualsiasi sequenza N20NGG con hU6 promotore 1,2,3. Tuttavia, altamente specifico Cas9 nucleasi come eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 sono sensibili ai mismatch gRNA-DNA all’estremità 5′29. Essi possono solo bersaglio GN19NGG sequenza quando il promotore hU6 viene utilizzato, limitando la selezione del sito di destinazione.
Uno studio precedente ha dimostrato che il mouse U6 (mU6) promotore può avviare sia adenina (A) o G trascrizione30, che potrebbe potenzialmente espandere la selezione del bersaglio. Abbiamo confrontato l’attività del promotore mU6 e hU6 promotore da espressione transitoria di gRNA per l’editing del genoma in WT-SpCas9-esprimendo cellule HEK293T (Fig. 1a). Il promotore mU6 ha mostrato attività simile al promotore hU6 per 12 gRNA testati iniziati con G (Fig. 1b, c, Tabella 1; Fig. 1a supplementare). Abbiamo testato nove gRNA iniziati con A ma privi di G a 1-4 nucleotidi, evitando gRNA troncati funzionali trascritti da G (Tabella 1). Con nostra sorpresa, entrambi i promotori potrebbero promuovere l’editing del genoma con gRNA iniziati con A (Fig. 1d, e; Fig. 1b supplementare). Tra tutti i nove gRNA testati, solo un gRNA (A8) guidato da hU6 visualizzato bassa efficienza. Abbiamo testato ulteriori nove gRNA iniziato con A, ma conteneva G a 1-5 nucleotidi. In questo caso, il promotore mU6 ha mostrato un’attività generalmente superiore al promotore hU6 (Fig. 2a-c supplementare). Successivamente, abbiamo confrontato l’attività del promotore mU6 e del promotore hU6 in cellule HeLa, e hanno mostrato un’attività simile (Fig. 3a-f supplementare). Inoltre, abbiamo confrontato l’attività del promotore mU6 e del promotore hU6 in un vettore lentivirus, e hanno mostrato un’attività simile in due punti temporali, giorno 3 e giorno 5, dopo la trasduzione (Fig. 4a, b). I nostri risultati sono coerenti con uno studio molto recente che il promotore hU6 può trascrivere piccoli RNA iniziati con A31.
Sia il promotore mU6 che il promotore hU6 permettono di trascrivere gRNA iniziati con A o G per l’editing del genoma. Questi due promotori sono stati utilizzati per trascrivere gRNA iniziati con A o G nucleotide. b, c Confronto dei promotori mU6 e hU6 per l’editing del genoma con gRNA iniziati con G. I dati sono mostrati come media ± s.d. (n = 2). d, e Confronto del promotore mU6 per l’editing del genoma con gRNA iniziati con A. I dati sono mostrati come media ± s.d. (n = 2). f Confronto del promotore mU6 per l’editing del genoma con gRNA iniziati con A o G tre giorni dopo la trasfezione. g Confronto del promotore mU6 per l’editing del genoma con gRNA iniziati con A o G 5 giorni dopo la trasfezione. I dati sono mostrati come media ± s.d. P > 0.05; P < 0.05 da due vie ANOVA (n = 2). I dati di origine sono forniti come un file di dati di origine
In seguito, abbiamo testato l’attività del promotore mU6 per l’editing del genoma con gRNA iniziati con C o T, ma modificati in A o G (Tabella 1). Dopo 3 giorni di editing del genoma, i gRNA iniziati con G hanno mostrato una maggiore attività per tre dei cinque gRNA testati (Fig. 1f; Fig. 5a supplementare), ma la differenza è stata eliminata dopo 5 giorni (Fig. 1g; Fig. 5b supplementare). Il promotore mU6 è stato scelto nello studio seguente.
Una strategia per il test high-throughput dell’attività dei gRNA
Un recente studio ha dimostrato che una strategia di coppia RNA guida-target permette il test high-throughput dell’attività dei gRNA per Cpf132. In questa strategia, le sequenze sintetizzate di RNA guida-target sono consegnate in cellule che esprimono Cas9 da lentivirus (Fig. 2a). Dopo l’editing del genoma, le sequenze bersaglio sono PCR-amplificato per il sequenziamento profondo, permettendo la misura diretta di inserzione / cancellazione (indel) tassi indotti da nucleasi Cas9. Un ulteriore vantaggio è che lentivirus preferibilmente integrare in regioni trascrizionalmente attive che sono molto più accessibili per il CRISPR / Cas9 macchinari 32,33,34, riducendo al minimo l’influenza di editing del genoma da accessibilità cromatina. Pertanto, il set di dati ottenuti da questa strategia fornisce l’opportunità di chiarire l’attività intrinseca di gRNA basato esclusivamente sulle loro caratteristiche di sequenza.
Una strategia di coppia RNA-target guida per lo screening ad alta produttività dell’attività dei gRNA in cellule umane. a Diagramma schematico della strategia di coppia RNA-target guida per il test di attività dei gRNA. Un vettore lentivirale contiene un promotore mU6 e una coppia RNA-target guida. Il vettore è stato utilizzato per trasdurre le cellule che esprimono Cas9 nucleasi. Indelli sarebbe indotta a obiettivi integrati dai corrispondenti gRNA. b Schema di progettazione e di screening ad alta produttività di una libreria gRNA. Una libreria di 80.263 coppie guida RNA-target è stato progettato e sintetizzato da microarray. Gli oligonucleotidi sono stati amplificati mediante PCR e clonati in vettori lentivirali mediante assemblaggio Gibson. La libreria è stata confezionata in virus e trasdotta in cellule che esprimono le nucleasi Cas9 per l’editing del genoma. I siti bersaglio integrati sono stati amplificati mediante PCR per l’analisi di deep-sequencing. c La correlazione di Pearson della frequenza di indel tra le diverse ripetizioni dell’esperimento. d La distribuzione dell’attività del gRNA per le tre nucleasi Cas9
Doench et al. hanno sviluppato uno strumento online che permette la progettazione di gRNA per il knockout genico con WT-SpCas925. Questo strumento analizza un’intera sequenza di codifica genica e classifica tutti i gRNA in base all’attività e agli effetti off-target. Abbiamo usato questo strumento per progettare gRNA per lo screening della libreria. Quattro top-ranked gRNA iniziati con A o G sono stati selezionati per ogni gene (Fig. 2b). Abbiamo anche progettato gRNAs targeting microRNAs. Poiché le lunghezze delle sequenze codificanti microRNA sono molto più brevi delle regioni codificanti dei geni, abbiamo in genere progettato tre gRNA per ogni microRNA. Un totale di 80.263 oligonucleotidi che contengono gRNA e sequenze bersaglio corrispondenti (75.312 gRNA per 19.037 geni codificanti; 4951 gRNA per 1549 microRNA) sono stati sintetizzati da microarray (dati supplementari 1). Gli oligonucleotidi sono stati amplificati in PCR e clonati nei vettori lentivirus tramite assemblaggio Gibson. Analisi della libreria plasmidica da sequenziamento profondo ha rivelato che il tasso di errore (Una lettura contiene qualsiasi mutazione è stato considerato come un errore) indotta dalla sintesi oligonucleotide o amplificazione PCR a guida RNA-regione di sequenza bersaglio era 36.5%. Questa libreria di plasmidi è stata utilizzata nei seguenti esperimenti di screening in pool per profilare l’attività gRNA per WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1.
La libreria è stata confezionata in lentivirus e trasdotta in cellule HEK293T che esprimono WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), o SpCas9-HF1 ad un MOI di 0,3. Dopo 5 giorni di editing del genoma, il DNA genomico è stato estratto, e le regioni bersaglio integrato sono stati amplificati PCR per il sequenziamento profondo (Fig. 2b). Le mutazioni alle regioni di sequenza guida RNA-target possono essere indotte sia da nucleasi Cas9 o dalla costruzione della biblioteca. Se una mutazione può essere trovato nella biblioteca originale, è stato considerato come una mutazione indotta dalla costruzione della biblioteca ed escluso dall’analisi indel. Gli indel potrebbero essere rilevati dal sequenziamento profondo nei siti bersaglio integrati (Fig. 6a supplementare). Abbiamo ottenuto validi tassi indel gRNA (legge numero > 100) di 55.604 (che copre 20.211 geni), 58.167 (che copre 20.315 geni), e 56.888 (che copre 20.270 geni) per WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente (dati supplementari 2). Per quanto a nostra conoscenza, questo è il più grande gRNA on-target set di attività riportato finora in cellule di mammifero.
Il test di screening è stato ripetuto sperimentalmente due volte, e due repliche indipendenti hanno mostrato un alto livello di correlazione per il tasso di indel (R = 0.92 per WT-SpCas9; R = 0.89 per eSpCas9 (1.1); R = 0.91 per SpCas9-HF1, Fig. 2c). Il tasso di indel di gRNA individuali ha anche una forte correlazione tra tre nucleasi Cas9 (Fig. 2c), indicando che alcune caratteristiche di sequenza sono favoriti per questi tre nucleasi Cas9. La distribuzione delle attività di gRNA varia notevolmente, da nessuna attività a tassi di indelebilità del 100% per queste tre nucleasi Cas9 (Fig. 2d). WT-SpCas9 ha mostrato una maggiore efficienza di editing di eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 nel nostro screening (Fig. 6b supplementare). Poiché si trattava di cloni derivati da una singola cellula che potrebbero influenzare le efficienze, abbiamo selezionato cinque gRNA e trasfettati insieme con le singole nucleasi Cas9 nelle cellule. WT-SpCas9 e SpCas9-HF1 ha mostrato un’attività simile, ma eSpCas9 (1.1) ha mostrato una minore attività al giorno 3 (Fig. 6c supplementare), coerente con gli studi precedenti 15,16.
È stato riportato che il DNA plasmidico residuo da procedure di confezionamento virale può contaminare le cellule trasdotte 35, con conseguente potenziale imprecisione nella misurazione dell’attività gRNA. Abbiamo progettato una coppia di primer specifici per la spina dorsale dei plasmidi per rilevare plasmidi residui, e una coppia di primer specifici per il DNA genomico lentivirus per rilevare sia plasmidi residui e lentivirus integrato nel genoma (Fig. 7a supplementare). Queste due coppie di primer hanno mostrato un’efficienza di amplificazione simile quando il DNA plasmidico è stato usato come template (Fig. 7b supplementare). Il DNA plasmidico residuo potrebbe essere rilevato in entrambi i virus non concentrati e virus concentrati durante il confezionamento del virus (Fig. 7b supplementare). Abbiamo trasdotto le cellule HEK293T ed estratto il DNA genomico al giorno 1 e al giorno 5 dopo la trasduzione, rispettivamente. Il DNA plasmidico residuo potrebbe essere rilevato in entrambi i campioni, ma le bande PCR erano molto deboli al giorno 5 con primer specifici per backbone, indicando che il plasmide residuo degradato nel tempo (Fig. 7b supplementare). Al contrario, bande molto forti potrebbero essere rilevate con primer specifici per i virus al giorno 5, indicando che i lentivirus sempre più integrati nel genoma. Questi risultati hanno suggerito che il DNA plasmidico residuo aveva solo un’influenza minima sullo schermo della libreria.
Caratteristiche della sequenza associate all’attività del gRNA
La caratterizzazione delle caratteristiche della sequenza associate all’attività del gRNA è fondamentale per lo sviluppo di strumenti di progettazione del gRNA. Questo set di dati su larga scala qui generato ci permette di valutare meglio quali caratteristiche hanno contribuito maggiormente all’attività del gRNA. Algoritmi tra cui alberi di regressione gradient-boosted e regressione Lasso sono stati utilizzati per valutare l’importanza delle caratteristiche 36. Tuttavia, alberi di regressione gradiente-boosted fornire punteggi di importanza Gini che riflettono solo il valore assoluto del contributo caratteristica, causando la perdita di informazioni riguardanti la direzione dell’effetto; regressione di lazo mostra scarsa capacità descrittiva. Fortunatamente, un algoritmo recentemente sviluppato SHAP (SHapley Additive exPlanation), un approccio unificato per spiegare l’output di qualsiasi modello di apprendimento automatico, può potenzialmente affrontare queste limitazioni37.
Abbiamo collegato XGBoost con SHAP (chiamato Tree SHAP) per valutare l’importanza di 1031 caratteristiche, comprese le caratteristiche identificate da Doench e Wong et al.25,38, e tutte le accessibilità posizione di gRNA caratteristiche struttura secondaria (dati supplementari 3, 4). Nel complesso, i punteggi previsti sono stati fortemente influenzati dalla posizione-dipendente composizione nucleotidica per tre nucleasi Cas9 (Fig. 3a-c; dati supplementari 4). Il nucleotide più favorito era G in posizione 20 (G_20), il nucleotide immediatamente adiacente alla sequenza PAM. Altre importanti caratteristiche sovrapposte nella top 20 per tre nucleasi sono la temperatura di fusione (Tm, favorita), il numero di dimeri TT (sfavorito), C_18 (favorito), l’energia libera di auto-piegamento (favorito), e G_14 (sfavorito).
Analisi dell’importanza delle caratteristiche associate all’attività del gRNA tramite Tree SHAP. a-c Top 20% delle caratteristiche importanti identificate da Tree SHAP per WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente. I nucleotidi, così come la loro posizione, sono stati mostrati sulla sinistra. GG_19 significa GG dimer start in posizione 19. Tm significa temperatura di fusione
Abbiamo poi valutato la composizione nucleotidica dipendente dalla posizione del 25% più alto di gRNA attivi rispetto al 25% più basso di gRNA attivi. I risultati hanno rivelato che G era generalmente favorito, e T era generalmente sfavorito (Fig. 4a-c; Dati supplementari 5). G_20 è stato fortemente favorito per tutte e tre le nucleasi Cas9, coerente con l’analisi SHAP dell’albero. Le differenze di preferenza nucleotide tra WT-SpCas9 e varianti SpCas9 sono stati osservati anche. Le differenze di nucleotide preferito in posizione 3 (C/G vs G), 9 (G vs C/G), 10 (A/G vs A/C), 14 (C vs A/T), 16 (A/C vs C), 17 (G vs A), e 18 (C/G vs C) sono state osservate tra WT-SpCas9 e eSpCas9(1.1). Le differenze di nucleotide preferito in posizione 3 (C/G vs G), 5 (G vs C/T), 7 (C/G vs G), 9 (G vs C/G), 10 (A/G vs C), 12 (A/G vs A), 14 (C vs A/T), 17 (G vs A/C), e 18 (C/G vs C) sono state osservate tra WT-SpCas9 e SpCas9-HF1. Inoltre, abbiamo analizzato la composizione nucleotidica indipendente dalla posizione con il 20% di gRNA attivi (Fig. 4d-f). Il contenuto di G (favorito) e T (sfavorito) ha fortemente influenzato l’attività del gRNA, mentre il contenuto di A e C ha leggermente influenzato l’attività del gRNA per tre nucleasi Cas9, coerentemente con i valori di SHAP dell’albero.
Influenza della composizione nucleotidica sull’attività dei gRNA. a-c La composizione nucleotidica dipendente dalla posizione del 25% più alto di gRNA attivi rispetto al 25% più basso di gRNA attivi. Le barre hanno mostrato i punteggi log-odds della frequenza del nucleotide per ogni posizione. I numeri sotto indicato la posizione dei nucleotidi sul DNA bersaglio. d-f L’associazione di ogni numero di nucleotide con attività gRNA. La dimensione dei cerchi indica la frequenza di indel
Performance degli algoritmi convenzionali
Oltre a generare set di dati sull’attività dei gRNA, un altro obiettivo di questo lavoro era quello di sviluppare strumenti di predizione per la progettazione di gRNA. Abbiamo valutato le prestazioni di quattro algoritmi convenzionali di previsione dell’attività di gRNA, tra cui la regressione lineare, la regressione lineare regolarizzata L2 (regressione Ridge), la regressione XGBoost, e i modelli multilayer perceptron (MLP) con set di dati generati in questo studio. Per evitare l’over-fitting, abbiamo separato casualmente il set di dati in due sottogruppi con 85% dei dati utilizzati come set di dati di formazione per addestrare i modelli, e il restante 15% tenuto fuori utilizzato per testare la capacità di generalizzazione dei modelli addestrati (Fig. 5a). Per ottenere prestazioni ottimali, le caratteristiche con alti valori di SHAP dell’albero sono state modellate negli algoritmi (Dati supplementari 4).
Performance di diversi algoritmi per la predizione dell’attività del gRNA. a Schema del set di dati e degli algoritmi convenzionali. Sono stati costruiti quattro algoritmi convenzionali tra cui regressione lineare, regressione ridge, regressione XGBoost e MLP, rispettivamente. In tutto, l’85% del set di dati rilevanti è stato utilizzato come set di allenamento, e il 15% riservato del set di dati in ogni set come set di prova per misurare la capacità di generalizzazione di ogni modello per prevedere i dati non visti. b Schema del set di dati e algoritmi di apprendimento profondo. Sono stati costruiti algoritmi di deep-learning tra cui CNN, RNN e RNN + biofeature, rispettivamente. In totale, il 76,5% del set di dati rilevanti è stato utilizzato come set di allenamento, l’8,5% del set di dati in ogni set è stato utilizzato come set di convalida, e il 15% riservato del set di dati in ogni set è stato utilizzato come set di prova per misurare la capacità di generalizzazione di ogni modello per prevedere i dati non visti. c-e prestazioni dei diversi algoritmi per la previsione attività gRNA rivelato dalla correlazione Spearman per WT-SpCas9, eSpCas9 (1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente. Il grafico a barre mostra la media ± s.d. per il coefficiente di correlazione Spearman tra previsto e misurato punteggi di attività gRNA (n = 10)
Di quattro algoritmi testati qui, MLP è il più predittivo, con coefficienti di correlazione Spearman di 0.8416, 0.8457, e 0.8440 per WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente (Fig. 5c-e; Dati supplementari 6-8). XGBoost è il secondo più predittivo, con coefficienti di correlazione Spearman di 0.8454, 0.8310, e 0.8184 per WT-SpCas9, eSpCas9 (1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente. Anche la regressione lineare e la regressione ridge hanno funzionato bene, ma con un punteggio di correlazione relativamente più basso. Abbiamo anche provato la regressione lasso e la regressione SVM. Ma il coefficiente di penalità per la regressione lasso è quasi zero, il che lo ha reso equivalente al modello lineare. La regressione SVM non è riuscita a finire il benchmarking sulla scala attuale del set di dati entro un tempo ragionevole (3 settimane). Sono stati abbandonati nel confronto finale.
Performance degli algoritmi di deep-learning
Studi recenti hanno dimostrato che due algoritmi basati sul deep-learning, la rete neurale convoluzionale (CNN) e la rete neurale ricorrente (RNN), sono strumenti potenti per l’analisi di sequenze di DNA/proteine39,40,41,42,43. Essi potrebbero ottenere caratteristiche utili da DNA grezzo / sequenza proteica automaticamente senza requisito di ingegneria caratteristica. CNN è stato utilizzato per prevedere l’attività gRNA per Cpf1 e WT-SpCas926,27, mentre RNN non è stato utilizzato per la previsione attività gRNA finora. Abbiamo addestrato sia CNN e RNN per la previsione di attività gRNA. Per evitare l’over-fitting, abbiamo separato in modo casuale il set di dati in tre sottogruppi con 76,5% dei dati utilizzati come set di dati di formazione per addestrare i modelli, 8,5% utilizzato come set di dati di convalida, e il restante 15% tenuto fuori utilizzato per testare la capacità di generalizzazione dei modelli formati (Fig. 5b).
RNN ha superato CNN e altri algoritmi per la previsione di attività gRNA con coefficienti di correlazione Spearman di 0.8555, 0.8491, e 0.8512 per WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente (Fig. 5c-e; Dati supplementari 6-8). CNN ha ottenuto prestazioni simili a XGBoost con coefficienti di correlazione Spearman di 0.8455, 0.8313, e 0.8343 per WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente.
Un modello integrato migliora il potere predittivo
La spina dorsale degli algoritmi di apprendimento profondo (CNN o RNN) può solo sfruttare la composizione di k-mer o le sue dipendenze39,44. Studi recenti sulla predizione delle proteine hanno dimostrato che la capacità di predizione dei modelli di deep-learning potrebbe essere potenziata dall’aggiunta di altre caratteristiche, come il peso molecolare, l’idrofobicità e la carica assoluta, che non potrebbero essere ottenute automaticamente dai modelli di deep-learning45,46. Nel nostro lavoro, caratteristiche di sequenza indiretta tra cui accessibilità posizione della struttura secondaria, stem-loop della struttura secondaria, temperatura di fusione, e il contenuto di GC sono fortemente associati con l’attività gRNA (dati supplementari 4), ma non poteva essere ottenuto da deep learning. Considerando che il modello RNN ha ottenuto le migliori prestazioni di tutti gli algoritmi, abbiamo quindi combinato queste caratteristiche biologiche con RNN per la previsione di attività gRNA. È interessante notare che l’aggiunta di queste caratteristiche a RNN aumentato il potere di previsione, con coefficienti di correlazione Spearman di 0.8670, 0.8624, e 0.8603 per WT-SpCas9, eSpCas9 (1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente (Fig. 5c-e). Pertanto, RNN integrato con caratteristiche biologiche (di seguito denominato RNN + Biofeature) è stato utilizzato come il modello finale per la previsione di attività gRNA (Fig. 6).
Modello DeepHF per la previsione dell’attività del gRNA. La sequenza originale di gRNA viene prima codificata e poi incorporata per ottenere una nuova rappresentazione. Questa nuova rappresentazione viene ulteriormente elaborata da un BiLSTM per ottenere la rappresentazione finale che viene poi concatenata con caratteristiche create a mano per servire come input dello strato completamente connesso per essere trasformato in modo non lineare. Infine, viene eseguita una trasformazione lineare per ottenere il punteggio di predizione
Per testare ulteriormente le prestazioni dei sette modelli utilizzati in questo studio, abbiamo generato una lista di gRNA indel per siti endogeni (85 siti per WT-SpCas9, 81 siti per eSpCas9(1.1), e 82 siti per SpCas9-HF1) (Dati supplementari 9). Tutti e sette i modelli hanno funzionato notevolmente bene, ma la regressione lineare e la regressione ridge sono stati meno predittivi sulla base delle metriche di correlazione Spearman (Figg. supplementari 8-10). A causa del limitato set di dati qui, non abbiamo potuto concludere quale algoritmo fosse statisticamente migliore degli altri algoritmi sui siti endogeni. Abbiamo anche studiato la correlazione della frequenza indel agli obiettivi sintetici con quella ai corrispondenti obiettivi endogeni. La correlazione di Spearman è 0,722, 0,767, e 0,730 per WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente (Supplementary Fig. 11a-c).
Confronto del modello RNN + Biofeature con i modelli esistenti
Ci sono diversi set di dati pubblicamente disponibili di efficienza gRNA per WT-SpCas9, che ci permette di confrontare le prestazioni del modello RNN + Biofeature per WT-SpCas9 (di seguito denominato DeepWt) con modelli di previsione esistenti. Abbiamo testato DeepWt contro 18 set di dati endogeni raccolti da Haeussler et al.47, e ottenuto coefficienti di correlazione Spearman varia da 0.129 a 0.594 (dati supplementari 10). È stato riportato che il modello di predizione dipende fortemente dal fatto che il gRNA è espresso da un promotore U6 in cellule o da un promotore T7 in vitro47,48. Pertanto, la strategia di apprendimento di trasferimento è stato utilizzato per migliorare la capacità di previsione del nostro modello in condizioni di espressione diverse. Per l’espressione promotore U6, le prestazioni sono state migliorate da fine-tuning dell’ultimo strato nascosto di DeepWt con XuKBM set di dati (dati supplementari 10). Il nostro modello finale ottimizzato, chiamato DeepWt_U6, ha superato altri sette popolari strumenti di progettazione gRNA (Fig. 7a). In particolare, dal momento che la nostra libreria gRNA è stato progettato, in parte, da RuleSet2 che è stato sviluppato da set di dati Doench, questo confronto può avere un pregiudizio per DeepWt_U6 su set di dati Doench. Per l’espressione del promotore T7, abbiamo sviluppato un altro modello chiamato DeepWt_T7 da fine-tuning di RNN + algoritmo biofeature con Moreno-Mateos2015 set di dati. Questo modello ha superato gli altri modelli per la progettazione di gRNA espressi in vitro (Fig. 7b).
Mappa di calore dei coefficienti di correlazione Spearman rank tra punteggi di efficienza e set di dati. a gRNA trascritti in cellule da un promotore U6. b gRNA trascritti in vitro da un promotore T7. Il tipo di cellula, il numero di gRNA e la specie sono mostrati sulla sinistra. I punteggi sono mostrati lungo l’asse orizzontale, i set di dati sulla verticale. Le correlazioni di un algoritmo rispetto al proprio set di dati di addestramento sono mostrate in grigio perché è probabile che siano sovrastimate a causa dell’over-fitting. I punteggi più alti sono in grassetto
È stato riportato che l’integrazione di metriche di accessibilità del sito di destinazione nel modello potrebbe migliorare il potere di previsione26,27. Per WT-SpCas9, abbiamo messo a punto il modello DeepWt_U6 con DNase I dati della linea cellulare KBM-7 ottenuto da ENCODE, con conseguente modello DeepWt_Chromatin. I set di dati Wang/Xu HL60 e Hart Hct116-2 Lib 1 e i corrispondenti dati DNase I sono stati utilizzati per testare le prestazioni di DeepWt_Chromatin. Tuttavia, i punteggi di correlazione Spearman non sono stati migliorati (Dati supplementari 11). Abbiamo anche recuperato i dati DNase I delle cellule HEK293T dal database ENCODE e testato se l’integrazione delle metriche nei modelli potrebbe migliorare il potere di predizione per eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1. I dati DNase I sono stati elaborati seguendo il metodo descritto da Kim et al.26. Tuttavia, l’incorporazione di questi dati non poteva aumentare significativamente la capacità di predizione (dieci volte shuffled convalida) per eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 (dati supplementari 12).
I contributi nucleotidici rivelati da Deep SHAP
Oltre alla precisione di predizione, siamo anche interessati a capire i meccanismi del modello deep-learning. Lundberg e Lee49 hanno sviluppato un algoritmo chiamato Deep SHAP, che è un algoritmo di approssimazione ad alta velocità per i valori SHAP nei modelli di deep-learning. Abbiamo usato Deep SHAP per stimare il contributo del nucleotide dipendente dalla posizione al modello di deep-learning. Il contributo di ogni nucleotide dipendente dalla posizione all’attività del gRNA è stato calcolato dal valore medio di quella posizione in tutti i gRNA di formazione. Per rendere il contributo dei nucleotidi comparabili tra WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1, i valori SHAP profondi sono stati riscalati dallo Z-score (cioè, la standardizzazione). Il nucleotide con uno Z-score superiore a 1 o inferiore a -1 è stato considerato avere un contributo significativo all’attività del gRNA (Fig. 12a supplementare).
C’erano 16, 21, e 26 nucleotidi significativi in WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1, rispettivamente. Il risultato ha rivelato che G tipicamente aveva un contributo positivo e T tipicamente aveva un contributo negativo, in accordo con l’osservazione precedente che Cas9 lega preferenzialmente gRNA contenenti purine ma non pirimidine50. Inoltre, più T nello spaziatore causato bassa espressione gRNA51. Abbiamo trovato che la maggior parte dei nucleotidi significativi aveva la stessa direzione di contributo all’attività gRNA in tutte e tre le nucleasi Cas9. Coerentemente con diversi rapporti precedenti38,52, il più influente era i nucleotidi in posizione 20, dove G_20 aveva un forte contributo positivo e C_20/T_20 aveva un forte contributo negativo. Rispetto a WT-SpCas9, eSpCas9(1.1)-motivi specifici incluso A_15 (favorito), A_17 (favorito), G_6-8 (favorito), G_14 (sfavorito), G_16 (sfavorito), T_6 (sfavorito), T_11-12 (sfavorito); SpCas9-HF1-specifici motivi inclusi A_11 (favorito), A_13 (sfavorito), A_14-15 (favorito), A_19-20 (sfavorito), G_6-7 (favorito), G_14 (sfavorito), G_16 (sfavorito), T_4 (sfavorito), T_6 (sfavorito), e T_11 (sfavorito) (Fig. supplementare). 12a).
Inoltre, la differenza di Z-score tra le varianti di Cas9 e WT-SpCas9 è stata calcolata per valutare i cambiamenti nei contributi nucleotidici. La differenza superiore a 1 o inferiore a -1 è stata considerata come un cambiamento significativo (Fig. 12b supplementare). Sono state osservate diverse differenze nella direzione del contributo dei nucleotidi significativi. In particolare, A_13 ha contribuito negativamente a SpCas9-HF1 ma non a WT-SpCas9, G_17 ha contribuito positivamente a WT-SpCas9 ma non a eSpCas9(1.1) e HF1-SpCas9, G_18 ha contribuito positivamente a WT-SpCas9 ma ha contribuito negativamente a eSpCas9(1.1) (anche a HF1-SpCas9, ma non significativo).
Il contributo dei nucleotidi ripetitivi alle attività di gRNA sono stati anche studiati sulla base della somma dei valori Deep SHAP. Per WT-SpCas9, lo studio precedente ha dimostrato che un tratto di nucleotidi identici adiacenti (nucleotidi ripetitivi, come GGGG o TTTT) potrebbe essere associato con scarsa efficienza di un sgRNA38. Tuttavia, non hanno considerato gli effetti di posizione. Pertanto, abbiamo calcolato i valori medi Deep SHAP dei quattro nucleotidi ripetitivi tra cui AAAA, CCCC, GGGG e TTTT dalla posizione 1 alla 18 (dati supplementari 13). I nostri risultati hanno dimostrato che i nucleotidi ripetitivi generalmente diminuito l’efficienza indel, coerente con lo studio di Wong et al. Tuttavia, il contributo positivo di nucleotidi ripetitivi in alcune posizioni sono stati osservati, tra cui GGGG a partire dalla posizione 1-5 e 16-18, AAAA a partire dalla posizione 14, CCCC a partire dalla posizione 1-2 e 15-18 (dati supplementari 13). Il contributo positivo dei nucleotidi ripetuti in alcune posizioni è stato osservato anche per eSpCas9 (1.1) e SpCas9-HF1. Per esempio, AAAA a partire dalla posizione 14-15 ha contribuito positivamente alle attività gRNA per entrambe le nucleasi Cas9 (Dati supplementari 13).
La correlazione della frequenza indel al fenotipo
In questo studio, abbiamo usato il tasso indel come etichetta dell’attività gRNA, che non è uguale alla reale efficienza di knockout del gene. Abbiamo testato la correlazione tra la frequenza di indel e l’effettiva interruzione del gene con un test basato sulle proteine. Abbiamo progettato un totale di nove gRNA che prendono di mira SIRT1, SIRT2 e SIRT6 con tre gRNA per ciascuno. I gRNA e le nucleasi Cas9 sono stati introdotti in cellule HEK293T con un vettore episomale che ha permesso l’editing del genoma a lungo termine5. La frequenza indel e l’espressione proteica è stata analizzata al giorno 9 dopo la trasfezione. I risultati hanno rivelato che le frequenze indel avevano una buona correlazione con l’espressione della proteina (r = 0,82; Supplementary Fig. 13a, b). Inoltre, la correlazione tra la frequenza indel e l’effettiva interruzione del gene è stato testato da un saggio di luciferasi reporter. Abbiamo progettato un totale di 11 gRNAs targeting gene luciferasi. Cinque giorni dopo l’editing del genoma, la frequenza indel e l’attività della luciferasi sono stati analizzati. I risultati hanno rivelato che le frequenze indel avevano una buona correlazione con l’attività luciferasi (r = 0.70, Fig. supplementare 13c-e).
La correlazione tra on-target e off-target efficienza
L’obiettivo di questo lavoro è quello di progettare gRNA con una migliore attività on-target, ma tali gRNA possono essere maggiore tolleranza per i mismatch e quindi indurre maggiori mutazioni off-target. Per testare questa ipotesi, abbiamo selezionato tre sgRNA con attività diverse e progettato coppie guida-target con doppi mismatch (Fig. 14a supplementare). Off-target scissione si è verificato in modo efficiente con sequenze di destinazione contenenti mismatch in posizione 1-8 per WT-SpCas9 (Fig. supplementare 14b). Come previsto, una maggiore attività on-target ha portato generalmente ad una maggiore attività off-target. Per eSpCas9 (1.1) e SpCas9-HF1, tuttavia, il fuori bersaglio scissione era a livello di fondo tranne i mismatch in posizione 7-8, dove site1-gRNA visualizzato alto fuori bersaglio scissione (Supplementary Fig. 14b). Simile tolleranza mismatch è stato osservato anche da Slaymaker et al.15Site2-gRNA aveva attività paragonabile a site1-gRNA, ma il suo off-target scissione era a livello di fondo, indicando che la tolleranza mismatch dipende dalle sequenze gRNA.
Servizio online
Abbiamo infine sviluppato uno strumento online chiamato DeepHF (Deep learning per High-Fidelity Cas9) basato su RNN + modello biofeature per la progettazione gRNA per WT-SpCas9, eSpCas9(1.1), e SpCas9-HF1. Lo strumento online contiene tre moduli funzionali, ovvero il modulo di predizione, il modulo dei gRNA verificati e il modulo di progettazione. Il modulo di predizione permette agli utenti di ottenere le attività previste per tutti i gRNA con una sequenza di DNA in ingresso. Il modulo gRNAs verificato fornisce tutti i tassi di indel gRNA generati in questo studio. Il modulo di progettazione fornisce gRNA che sono adatti per il knockout genico con eSpCas9(1.1) e SpCas9-HF1 in cellule umane. In questo modulo, i gRNA sono stati scelti da trascrizioni comuni di ogni gene (Genome Reference Consortium Human Build 38). Le informazioni off-target (1-3 mismatch considerati come off-target) e la posizione di targeting (se nel 5-65% della sequenza codificante) sono stati anche annotati. Gli utenti possono ottenere i gRNA predefiniti inserendo un ID gene o un simbolo gene. Il sito web è liberamente disponibile all’indirizzo http://www.DeepHF.com/.