Tag fluorescente

Ci sono attualmente diversi metodi di etichettatura per tracciare le biomolecole. Alcuni dei metodi includono i seguenti.

Marcatori isotopiciModifica

Le specie comuni per le quali vengono usati i marcatori isotopici includono le proteine. In questo caso, gli aminoacidi con isotopi stabili di carbonio, azoto o idrogeno sono incorporati in sequenze polipeptidiche. Questi polipeptidi sono poi messi attraverso la spettrometria di massa. A causa dell’esatto cambiamento definito che questi isotopi subiscono sui peptidi, è possibile dire attraverso il grafico della spettrometria quali peptidi contengono gli isotopi. Così facendo, si può estrarre la proteina di interesse da diverse altre in un gruppo. I composti isotopici giocano un ruolo importante come fotocromi, descritti di seguito.

Biosensori colorimetriciModifica

I biosensori sono collegati a una sostanza di interesse. Normalmente, questa sostanza non sarebbe in grado di assorbire la luce, ma con il biosensore collegato, la luce può essere assorbita ed emessa su uno spettrofotometro. Inoltre, i biosensori che sono fluorescenti possono essere visti a occhio nudo. Alcuni biosensori fluorescenti hanno anche la capacità di cambiare colore in ambienti mutevoli (es: dal blu al rosso). Un ricercatore sarebbe in grado di ispezionare e ottenere dati sull’ambiente circostante in base al colore che potrebbe vedere visibilmente dalla specie ibrida biosensore-molecola.

I saggi colorimetrici sono normalmente utilizzati per determinare la concentrazione di una specie rispetto ad un’altra.

Composti fotocromaticiModifica

I composti fotocromatici hanno la capacità di passare tra una gamma o varietà di colori. La loro capacità di mostrare colori diversi sta nel modo in cui assorbono la luce. Diverse manifestazioni isomeriche della molecola assorbono diverse lunghezze d’onda della luce, così che ogni specie isomerica può mostrare un colore diverso in base al suo assorbimento. Questi includono composti fotoswitchable, che sono proteine che possono passare da uno stato non fluorescente a uno fluorescente dato un certo ambiente.

La molecola organica più comune per essere usata come fotocromo è il diarilene. Altri esempi di proteine fotocromatiche sono PADRON-C, rs-FastLIME-s e bs-DRONPA-s, che possono essere usate sia in cellule di piante che di mammiferi per osservare le cellule muoversi in ambienti diversi.

BiomaterialiModifica

I biomateriali fluorescenti sono un modo possibile di usare fattori esterni per osservare un percorso in modo più visibile. Il metodo comporta l’etichettatura fluorescente di molecole peptidiche che altererebbero il percorso naturale di un organismo. Quando questo peptide viene inserito nella cellula dell’organismo, può indurre una reazione diversa. Questo metodo può essere usato, per esempio, per trattare un paziente e poi vedere visibilmente il risultato del trattamento.

Sensori elettrochimiciModifica

I sensori elettrochimici possono essere usati per il rilevamento senza etichetta delle biomolecole. Essi rilevano i cambiamenti e misurano la corrente tra un elettrodo metallico sondato e un elettrolita contenente l’analita bersaglio. Un potenziale noto all’elettrodo viene poi applicato da una corrente di ritorno e la corrente risultante può essere misurata. Per esempio, una tecnica che utilizza il rilevamento elettrochimico include l’aumento lento della tensione che causa l’ossidazione o la riduzione delle specie chimiche all’elettrodo. La corrente di cella contro la tensione viene tracciata, il che può infine identificare la quantità di specie chimiche consumate o prodotte all’elettrodo. I tag fluorescenti possono essere utilizzati insieme ai sensori elettrochimici per facilitare il rilevamento in un sistema biologico.

Etichette fluorescentiModifica

Tra i vari metodi di etichettatura delle biomolecole, le etichette fluorescenti sono vantaggiose in quanto sono altamente sensibili anche a bassa concentrazione e non distruttive per il ripiegamento e la funzione della molecola bersaglio.

La proteina fluorescente verde è una proteina fluorescente naturale della medusa Aequorea victoria, ampiamente utilizzata per etichettare le proteine di interesse. La GFP emette un fotone nella regione verde dello spettro luminoso quando viene eccitata dall’assorbimento della luce. Il cromoforo consiste in un tripeptide ossidato -Ser^65-Tyr^66-Gly^67 situato all’interno di un barile β. GFP catalizza l’ossidazione e richiede solo ossigeno molecolare. GFP è stata modificata cambiando la lunghezza d’onda della luce assorbita per includere altri colori di fluorescenza. YFP o proteina fluorescente gialla, BFP o proteina fluorescente blu, e CFP o proteina fluorescente ciano sono esempi di varianti GFP. Queste varianti sono prodotte dall’ingegneria genetica del gene GFP.

Sonde fluorescenti sintetiche possono anche essere usate come etichette fluorescenti. I vantaggi di queste etichette includono una dimensione più piccola con una maggiore varietà di colori. Possono essere utilizzate per etichettare le proteine di interesse in modo più selettivo con vari metodi tra cui l’etichettatura chimica basata sul riconoscimento, come l’utilizzo di tag peptidici chelanti il metallo, e l’etichettatura biologica basata sul riconoscimento che utilizza reazioni enzimatiche. Tuttavia, nonostante la loro vasta gamma di lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione e la loro migliore stabilità, le sonde sintetiche tendono ad essere tossiche per la cellula e quindi non sono generalmente utilizzate negli studi di imaging cellulare.

Le etichette fluorescenti possono essere ibridate al mRNA per aiutare a visualizzare l’interazione e l’attività, come la localizzazione del mRNA. Un filamento antisenso marcato con la sonda fluorescente è attaccato ad un singolo filamento di mRNA, e può quindi essere visualizzato durante lo sviluppo cellulare per vedere il movimento dell’mRNA all’interno della cellula.

Etichette fluorogeneModifica

Un fluorogene è un ligando (ligando fluorogenico) che non è di per sé fluorescente, ma quando è legato ad una specifica struttura di proteine o RNA diventa fluorescente.

Per esempio, FAST è una variante della proteina gialla fotoattiva che è stata ingegnerizzata per legare mimici chimici del cromoforo tripeptide GFP.

Allo stesso modo, l’aptamatore di spinaci è una sequenza di RNA ingegnerizzata che può legare mimici chimici del cromoforo GFP, conferendo così una fluorescenza condizionata e reversibile alle molecole di RNA contenenti la sequenza.