La hipertrofia del ligamentum flavum en la estenosis de la columna lumbar se asocia a un mayor nivel de miR-155

Resumen

La hipertrofia del ligamentum flavum (LF) contribuye a la estenosis de la columna lumbar (LSS) y está causada principalmente por la fibrosis. Datos recientes indican que miR-155 desempeña un papel crucial en la patogénesis de diferentes enfermedades fibróticas. Este estudio pretendía probar la hipótesis de que miR-155 ejerce efectos sobre el grosor del LF regulando la expresión del colágeno. Encontramos que el grosor del LF y la expresión del colágeno I y, del colágeno III eran mayores en el LF de los pacientes con LSS que en el LF de los pacientes con hernia de disco lumbar (LDH) (). La expresión de miR-155 fue significativamente mayor en el LF del grupo de LSS que en el LF del grupo de LDH (). El nivel de miR-155 se correlacionó positivamente con el grosor del LF (, ), el nivel de colágeno tipo I (, ) y el nivel de colágeno tipo III (, ). El mímico de miR-155 aumentó la expresión de ARNm y de proteínas del colágeno I y del colágeno III en los fibroblastos aislados del LF, mientras que la esponja de miR-155 disminuyó la expresión de ARNm y de proteínas del colágeno I y III en los fibroblastos. En conclusiones, miR-155 es un miRNA asociado a la fibrosis y puede jugar un papel importante en la patogénesis de la hipertrofia de LF.

1. Introducción

La estenosis espinal lumbar (LSS) es una condición común en pacientes de edad avanzada. El LSS se define como el estrechamiento del canal espinal con pinzamiento de la médula o de la raíz nerviosa que da lugar a los síntomas de radiculopatía o pseudoclaudicación . La hipertrofia del ligamentum flavum (LF) suele estar implicada en la patogénesis del LSS, que puede reducir el diámetro del canal espinal y comprimir el saco dural y las raíces nerviosas, dando lugar a síntomas, incluso en ausencia de un anillo fibroso abultado o de un núcleo pulposo herniado o de espolones óseos.

El LF es una estructura elástica bien definida que consta de fibras elásticas (80%) y de colágeno (20%) . Los tejidos de LF hipertrofiados se desorganizan y muestran una disminución de los niveles y degeneración de las fibras elásticas pero un aumento de los niveles de las fibras de colágeno . Durante la hipertrofia del LF, se produce un aumento de la expresión y la actividad de varias moléculas, como las metaloproteasas de la matriz (MMP) , los inhibidores tisulares de las metaloproteasas de la matriz (TIMP) , el factor de crecimiento derivado de las plaquetas-BB (PDGF-BB) , el factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) , la proteína morfogenética ósea (BMP) y las citoquinas inflamatorias .

Los microARNs (miARNs) son moléculas de ARN no codificante de 19-24 nucleótidos, conservadas evolutivamente, que controlan la expresión de los genes a nivel postranscripcional. Las firmas de expresión de los miARNs se han asociado con las características clinicopatológicas y los resultados de diferentes enfermedades . Sin embargo, se sabe muy poco sobre el papel de los miRNAs en la hipertrofia del LF. Los miRNAs juegan un papel crucial en la degradación de los tejidos y la fibrosis . Los miRNAs podrían promover la degradación del cartílago a través de la regulación de la expresión de los genes que codifican los factores catabólicos como MMP y ADAMTS . En particular, se ha observado un aumento significativo de la expresión de miR-155 en células de fibroblastos y tejidos de pacientes con artritis reumatoide. MiR-155 es un miRNA multifuncional típico que desempeña un papel crucial en varios procesos fisiológicos y patológicos, como la diferenciación del linaje hematopoyético, la inmunidad, el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la respuesta inflamatoria .

En este estudio, nos propusimos explorar el papel potencial de miR-155 en el desarrollo de la hipertrofia del FL en pacientes con LSS. Comparamos el grosor, la degradación de la elastina, la fibrosis, la expresión del colágeno I y del colágeno III, y la expresión de miR-155 en LF de pacientes con LSS con los de pacientes con hernia de disco lumbar (LDH). A continuación, investigamos la correlación entre el nivel de miR-155 y las características del LF. Por último, examinamos los efectos de miR-155 en la expresión de los tipos I y III de colágeno en células de LF humanas cultivadas.

2. Métodos

2.1. Especímenes

Se obtuvieron muestras de LF de 15 pacientes (7 hombres, 8 mujeres, edad media: 65,67 años, rango: 63-71 años) que se sometieron a una laminectomía descompresiva debido a una estenosis lumbar degenerativa sintomática. Como control, se obtuvieron muestras de LF de 15 pacientes (10 hombres, 5 mujeres, edad media: 25,17 años, rango: 20-30 años) con hernia discal lumbar que fueron tratados operativamente por este trastorno. Se tomaron muestras de los LF de L4/5 y se sometieron a tinción histológica, tinción de tricrómico de Masson, análisis inmunohistoquímico y evaluación biológica. El estudio fue aprobado por la junta de revisión ética institucional y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente.

2.2. Medición del grosor del LF

Se realizó una resonancia magnética (RM) para medir el grosor del LF en cada uno de los 30 pacientes. En la imagen axial ponderada en T1 a través de la articulación facetaria, el LF se observó claramente como una masa de baja intensidad de señal justo en el lado ventral de la articulación facetaria . Un cirujano experimentado trazó el grosor máximo del LF mediante la técnica del cursor manual y lo midió automáticamente en el sistema PACS. La medición de cada ligamento se repitió tres veces, y el valor medio se utilizó como el grosor final del LF.

2.3. Análisis histológico

Los especímenes se cortaron sagitalmente, se fijaron en formol al 10% durante 48 h y se incrustaron en un bloque de parafina. Se prepararon cortes finos (4 μm) y se tiñeron con tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de tricrómico de Masson por un patólogo experimentado que desconocía el origen de los especímenes. La tinción H&E reveló la morfología y la estructura del LF y el grado de degradación de la elastina. La tinción con tricrómico de Masson se utilizó para identificar la fibra elástica (rosa) y la fibra colágena (azul) y para determinar el grado de fibrosis.

2.4. PCR en tiempo real

Se aisló el ARN total de las muestras o células utilizando TRIZOL (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Para medir los niveles de expresión del ARNm de los tipos I y III, se transcribió el ADNc de forma inversa a partir del ARN aislado incubando 500 ng de ARN tratado con DNasa con un kit de síntesis de primera cadena (Advanced Biotechnologies). La PCR en tiempo real se realizó utilizando el colorante verde SYBR en un termociclador con los siguientes parámetros 40 ciclos, 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 20 segundos y 72°C durante 15 segundos. Para medir el nivel de miR-155, se realizó la RT-PCR con el kit de detección de miRNA qRT-PCR All-in-One (Tiangen). Se utilizaron los siguientes cebadores: colágeno I forward: 5′-GTGCGATGACGTGATCTGTGA-3′, reverse: 5′-CGGTGGTTTCTTGTCGGT-3′; colágeno III hacia adelante: 5′-GCCAAATATGTGTCTGTGACTCA-3′ y reverso: 5′-GGGCGAGTAGGAGCAGTTG-3′; miR-155 forward TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT. Todos los cebadores fueron sintetizados por Shenggong Inc. Todos los datos se analizaron utilizando el método comparativo ΔΔCT para calcular la diferencia entre los valores del ciclo umbral (CT) de los genes diana y de referencia en cada muestra.

2.5. Análisis de Western Blot

Las muestras de tejido y las células cultivadas se lisaron en tampón RIPA que contenía un cóctel de inhibidores de proteasa. Cantidades equivalentes de proteínas se separaron por electroforesis y se transfirieron a una membrana de transferencia Immobilon-P (Millipore). Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% en solución salina tamponada con Tris y luego se incubaron con anticuerpos monoclonales Col 1 o Col 3 (Abcam, EE.UU.), seguidos de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (Abcam, EE.UU.). La actina (Abcam, USA) se utilizó como control de carga.

2.6. Cultivo primario de células de fibroblastos de LF

Las muestras de LF se obtuvieron asépticamente de seis pacientes jóvenes sometidos a cirugía de la columna vertebral. Las muestras disecadas se picaron en trozos pequeños y se digirieron en medio libre de suero (Gibco) que contenía 250 U/mL de colagenasa tipo I (Sigma) a 37°C en una atmósfera que contenía 5% de CO2. Las muestras digeridas se lavaron con un medio que contenía suero para inhibir la actividad de la colagenasa y, a continuación, se colocaron en placas de 35 mm en medio Eagle modificado de Dulbecco y medio F-12 de Ham (DMEM/F12, Gibco) complementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS, Gibco-BRL). Los cultivos se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. El medio se cambió cada dos días. Al cabo de dos semanas, las células comenzaron a migrar desde los chips de ligamento y formaron una monocapa. Las células se mantuvieron durante dos o tres semanas en DMEM/F12 con un 10% de FBS, 1% v/v de penicilina y estreptomicina (Sigma) en una incubadora con una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2. Los niveles de expresión proteica de los tipos I y III de colágeno se detectaron mediante inmunocitoquímica como se ha descrito previamente.

2.7. Construcción del vector

La secuencia del precursor de hsa-miR-155 se obtuvo de miRBase (http://www.mirbase.org/): CTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGTTTGCCTCCAACTGACTCCTACATATTAGCATTAACAG. La secuencia de hsa-miR-155 era UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU, y la secuencia complementaria de ADN era ACCCCTATCATACAGCATTAA. Las esponjas de miR-155 se diseñaron como tres secuencias complementarias incompletas. Los oligos se clonaron en pCDH-GFP para hacer el plásmido pCDH-miR-155 o pCDH-miR-155-esponja.

2.8. Empaquetado e infección del lentivirus

Para la transfección, las células 293T se cultivaron a 37°C en un incubador con un 5% de CO2 hasta que las células alcanzaron un 70-80% de confluencia, y las células en monocapa se transfectaron con el plásmido PCDH-GFP, pCDH-miR-155 o pCDH-miR-155-sponge mezclado con psPAX2 y pMD utilizando liposomas. El medio de cultivo se descartó después de 4 h, y las células se lavaron 3 veces con PBS. Por último, se añadieron 15 mL de medio de cultivo celular que contenía un 10% de suero bovino fetal y se cultivaron las células durante 24 h. A continuación, se recogieron los sobrenadantes que contenían GFP (grupo blanco), miR-155 (grupo OE) o lentivirus de esponja de miR-155 (grupo esponja) y se utilizaron para infectar células de fibroblastos. Otro lentivirus que contenía un miRNA sin sentido se utilizó como control (grupo CON).

2.9. Análisis estadístico

Los datos se expresaron como la media ± SD y se analizaron utilizando el paquete de análisis estadístico SPSS versión 12 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Las mediciones del grosor del LF se compararon mediante la prueba t de Student. Las diferencias en los niveles de expresión del colágeno I, el colágeno III, el ARNm y la proteína, así como el nivel de miR-155 entre los grupos se evaluaron mediante un ANOVA unidireccional. Las correlaciones entre el grosor del LF, el colágeno I, el colágeno III y los niveles de miR-155 se analizaron mediante el método de Spearman. se consideró estadísticamente significativa.

3. Resultados

3.1. Espesor del LF

Se midió el espesor de la porción media del LF. El grosor medio del LF fue de 2,8 ± 0,7 mm (rango: 1,63-3,87 mm) en el grupo LDH y de 5,3 ± 1,0 mm (rango: 3,95-7,48 mm) en el grupo LSS. Esta diferencia fue significativa ().

3.2. Degradación de la elastina y fibrosis del LF

El análisis histológico mostró que el área de la fibra elástica disminuyó y el área del colágeno aumentó en el LF del grupo LSS, en comparación con el grupo LDH. En el grupo LDH, las fibras elásticas ricas estaban dispuestas en orden paralelo (Figuras 1(a) y 1(b)). Sin embargo, en el grupo LSS, las fibras elásticas estaban fragmentadas, desorganizadas y se perdían focalmente, acompañadas de la proliferación de fibras de colágeno (Figuras 1(c) y 1(d)). La tinción con tricrómico de Masson mostró que, en el LF del grupo LDH, una amplia zona se teñía de rosa y mostraba una disposición regular, lo que indicaba un estado normal no fibrótico (Figuras 1(e) y 1(f)), pero en el LF, del grupo LSS, una amplia zona se teñía de azul, lo que indicaba la presencia de fibrosis masiva (Figuras 1(g) y 1(h)).

(a)

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(h)

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(d)
(e)
(f)
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(h)

3.3. Expresión de los colágenos I y III en LF

Los niveles de expresión de ARNm de los colágenos I y III aumentaron significativamente en las muestras de LF del grupo LSS (Figura 2(a)). La expresión de la proteína de los colágenos I y III es mayor en las muestras de LF del grupo LSS que del grupo LDH (Figuras 2(b) y 2(c)).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 2

La expresión del colágeno I y del colágeno III en las muestras de LF de pacientes con LSS y LDH. (a) El análisis de PCR en tiempo real mostró que los niveles relativos de ARNm del colágeno I y del colágeno III en el LF eran significativamente mayores en el grupo LSS que en el grupo LDH. (b) El análisis de Western blot de la expresión del colágeno I y del colágeno III en el LF de los grupos LSS y LDH. (c) Los niveles relativos de proteína de colágeno I y colágeno III en LF fueron significativamente mayores en el grupo LSS que en el grupo LDH.

3.4. Nivel de miR-155 en LF

El nivel medio de miR-155 fue de 1.1748 ± 0,047 (rango: 1,1278-1,2218) en el grupo LDH y 5,1081 ± 0,703 (rango: 4,4051-5,8111) en el grupo LSS. El nivel de miR-155 fue significativamente mayor en las muestras de LF del grupo LSS que en las del grupo LDH (, Figura 3(a)). El análisis de correlación mostró que el nivel de miR-155 aumentaba en paralelo con el grosor del LF, mostrando una correlación positiva y significativa. El coeficiente de regresión fue de 0,958 (Figura 3(b)). Además, la expresión de los tipos I y III de colágeno mostró una correlación positiva y significativa con el nivel de miR-155 en el LF (Figura 3(c)). Los coeficientes de regresión fueron de 0,827 () y 0,825 () para los tipos I y III de colágeno, respectivamente.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 3

La expresión de miR-155 en muestras de LF de pacientes con LSS y LDH. (a) El nivel relativo de miR-155 en LF fue mayor en el grupo LSS que en el grupo LDH. (b) Correlación entre el nivel de miR-155 y el grosor del LF. (c) Un gráfico de dispersión que muestra las correlaciones positivas entre el nivel de miR-155 y los niveles de proteína de colágeno I/III en el LF. Los coeficientes de correlación fueron de 0,825 () y 0,827 (), respectivamente.

3.5. miR-155 eleva la expresión de los colágenos I y III en los fibroblastos de LF

Para determinar el papel de miR-155 en la regulación de la expresión de los colágenos tipo I y III en LF, aislamos fibroblastos de LF y los infectamos con lentivirus. El análisis de RT-PCR mostró que la expresión de ARNm de los tipos I y III de colágeno estaba aumentada en las células infectadas con lentivirus mímicos de miR-155 en comparación con los controles (Figura 4(a)). El análisis de Western blot mostró que la expresión proteica de los tipos I y III de colágeno estaba aumentada en las células infectadas con el lentivirus miR-155 mimic en comparación con los controles (Figuras 4(b) y 4(c)). La inmunocitoquímica confirmó que la tinción de los tipos I y III de colágeno era obviamente más fuerte en las células infectadas con lentivirus miR-155 mimic en comparación con los controles (Figuras 4(d)-4(g)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

Figura 4

El imitador de miR-155 aumenta la expresión de colágeno I y colágeno III en fibroblastos aislados de LF. (a) El análisis de PCR en tiempo real mostró que los niveles relativos de ARNm de colágeno I y colágeno III fueron significativamente mayores en el grupo OE que en los grupos Blank y Control. (b) El análisis de Western blot de la expresión del colágeno I y del colágeno III en diferentes grupos de fibroblastos. (c) Los niveles relativos de proteína de colágeno I y colágeno III fueron significativamente mayores en el grupo OE que en los grupos Blank y Control. (d) Grupo en blanco. (e) Grupo de control. (f) Tinción inmunocitoquímica del colágeno I en el grupo OE. (g) Tinción inmunocitoquímica del colágeno III en el grupo OE. El color marrón indica una tinción positiva.

En cambio, la expresión del ARNm del colágeno tipo I y III disminuyó en las células infectadas con el lentivirus esponja miR-155 en comparación con los controles (Figura 5(a)). De forma consistente, el análisis de Western blot mostró que la expresión proteica de los tipos I y III de colágeno estaba disminuida en las células infectadas con el lentivirus esponja miR-155 en comparación con los controles (Figuras 5(b) y 5(c)). La inmunocitoquímica confirmó que la tinción de los tipos I y III de colágeno era más débil en las células infectadas con el lentivirus esponja miR-155 en comparación con los controles (Figuras 5(d)-5(g)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

4. Discusión

El LF contiene una alta concentración de elastina, permitiendo la contracción durante la flexión y la elongación durante la extensión . Se sabe que la hipertrofia de la FL es la causa de la LSS, lo que conduce a la lumbalgia . En este estudio, encontramos que el grosor medio del LF en el grupo LSS era significativamente mayor que el del grupo LDH. También observamos una disposición irregular, ruptura, hinchazón y disminución de las fibras elásticas, hialinización y aumento del número de fibras de colágeno en el LF del grupo LSS. Además, descubrimos que los LF del grupo LSS mostraban una elevada puntuación de fibrosis. Estos resultados son consistentes con estudios anteriores que muestran un aumento en el contenido de colágeno (fibrosis) y una disminución de la relación elastina-colágeno en LF hipertrofiados.

Hasta donde sabemos, este es el primer informe que describe la relación entre la hipertrofia de LF y la expresión de miRNA. Estudios recientes han revelado un papel importante de miR-155 en la patogénesis de la osteoartritis y las enfermedades fibróticas . Aquí, nos centramos en el papel de miR-155 en la patogénesis de la hipertrofia del FL. Encontramos que miR-155 estaba significativamente regulado al alza en el tejido del LF de los pacientes con LSS en comparación con los pacientes con LDH. El análisis de correlación mostró que el aumento de la expresión de miR-155 se correlacionaba con el grosor, la puntuación fibrótica y la expresión de colágeno tipo I y III en el LF. Además, aislamos fibroblastos de LF y demostramos que miR-155 reguló al alza la expresión de colágeno tipo I y tipo III en estas células.

La inflamación crónica es un importante factor de riesgo para la hipertrofia de LF. La progresión de la hipertrofia del LF se acompaña de un alto grado de infiltración de macrófagos . Además, los macrófagos fueron identificados como una fuente celular importante de citoquinas inflamatorias en la hipertrofia del FL . Recientemente, se ha identificado el miR-155 como un componente de la respuesta primaria de los macrófagos a los mediadores inflamatorios . Además, varios estudios han demostrado que el factor de crecimiento transformante (TGF) está implicado en el proceso de cambios hipertróficos durante la FL. Curiosamente, miR-155 es una diana directa de la vía TGF-/Smad, que induce la expresión de miR-155 a través de Smad4 . miR-155 contribuye a la regulación de la vía TGF-/Smad dirigiéndose directamente a SMAD2 y SMAD5 . Estos hallazgos establecen un fuerte vínculo entre miR-155, la vía del TGF- y la hipertrofia del LF e indican que miR-155 es un factor crítico que regula la fibrosis de los fibroblastos y la hipertrofia del LF.

Hay varias limitaciones en nuestro presente estudio. En primer lugar, el tamaño de nuestra muestra estaba limitado por el comité de revisión ética. En segundo lugar, no pudimos recoger LF normales y, en su lugar, utilizamos muestras de control de pacientes con hernias discales, cuya edad media era significativamente más joven que la de los pacientes con estenosis espinal. Por lo tanto, no podemos excluir la posibilidad de que el envejecimiento pueda tener un impacto en la expresión de miR-155. Habría sido ideal contar con dos controles diferentes: especímenes emparejados por edad y género de pacientes sin estenosis y especímenes emparejados por género de adolescentes tardíos. El primero eliminaría la edad como variable independiente, ya que no todos los pacientes de edad avanzada desarrollan estenosis espinal. Es posible que, al igual que la aterosclerosis, una predisposición genética altere los factores bioquímicos que contribuyen a la condición patológica. Los especímenes de adolescentes tardíos que no tienen ningún cambio degenerativo nos permitirían determinar el alcance de las perturbaciones que se producen en la estenosis espinal. Lamentablemente, estos dos controles ideales rara vez se someten a tratamiento quirúrgico, lo que hace casi imposible reunir suficientes muestras a tiempo. Por lo tanto, finalmente nos decidimos por nuestros controles actuales. Aunque hay que admitir que no son ideales, son razonables y adecuados para probar la hipótesis que postulamos en este estudio. De hecho, en las literaturas sobre la hipertrofia del ligamentum flavum, el grupo de hernia discal joven se utilizó con frecuencia como grupo de control.

5. Conclusiones

En resumen, encontramos que miR-155 estaba regulado al alza en los pacientes con hipertrofia del ligamentum flavum lumbar. El nivel de expresión de miR-155 se correlacionó con el grosor y el grado de fibrosis del LF. miR-155 aumentó la expresión de colágeno tipo I y III en los fibroblastos del LF. Estos datos sugieren que miR-155 es un miRNA asociado a la fibrosis y puede desempeñar un papel importante en la patogénesis de la hipertrofia del LF.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este artículo.

Contribución de los autores

Jianwei Chen y Zhanchun Li diseñaron el estudio y escribieron el artículo. Jianwei Chen, Guibin Zhong, Lie Qian, Zhanchun Li, Zhiguang Qiao, Bin Chen y Hantao Wang realizaron los experimentos y analizaron los datos. Todos los autores leyeron y aprobaron el artículo final.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Zhiguang Qiao su trabajo preliminar para este estudio y agradecen al Centro de Investigación Biomédica del Hospital Renji de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghái el uso de instrumentos. El estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81370976) y la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghai, China (13zr1424900).