Duplicação translocada do segmento alvo do cromossoma 2 para o cromossoma 4 e uma triplicação translocada da estirpe portadora de uma estirpe
Construímos anteriormente estirpes contendo duplicações cromossómicas em tandem alvo. O cromossoma 2 de A. oryzae inclui genes que codificam protease alcalina e alfa-amilase, e os seus respectivos genes reguladores prtT e amyR, que são importantes para a fermentação. Consequentemente, estirpes contendo uma duplicação cromossómica tandem de 700-kb no cromossoma 2 mostraram um aumento das actividades de protease e amilase em condições de cultura em estado sólido . No presente estudo, duplicámos uma região de 1,4-Mb do cromossoma 2 e translocámos esta região para o fim do cromossoma 4 (Fig. 2). As duplicações translocadas com sucesso podem aumentar as actividades de protease e amilase em culturas em estado sólido, como demonstrado anteriormente pela duplicação em tandem do cromossoma 2 . Em análises subsequentes utilizando BLASTN, não foi encontrada nenhuma sequência de reconhecimento I-SceI no cromossoma da estirpe RIB40 de A. oryzae. Para translocar a região 1,4-Mb do cromossoma 2 para o fim do cromossoma 4, colocámos o marcador 5′ΔpyrG (integração direccionada da unidade básica de 5′ΔpyrG e subsequente selecção de ácido fluorótico 5) adjacente à região cromossómica do doador alvo. O marcador 3′ΔpyrG (integração direccionada da unidade básica de 3′ΔpyrG e subsequente selecção 5-FOA), que incluía a sequência de reconhecimento I-SceI, foi colocado adjacente à região cromossómica aceitante (Fig. 2, topo). A estirpe parental resultante foi então utilizada para gerar a duplicação translocada da região alvo do cromossoma 2. Para estes procedimentos, as células protoplásticas da estirpe parental foram preparadas e suavemente tratadas com meganuclease I-SceI e PEG. Os protoplastos tratados foram então incubados a 30 °C em placas de Czapek-Dox com meio mínimo (CZ) contendo 1,2 M de sorbitol. Após mais de 2 semanas de incubação, observámos uma colónia que foi regenerada a partir de protoplastos tratados. A frequência do número de colónias regeneradas era de aproximadamente 10-8 por célula. Para confirmar que a duplicação translocada foi alcançada na estirpe regenerada, o ADN genómico da estirpe regenerada foi extraído e analisado por PCR utilizando iniciadores que visavam a borda da região translocada (Fig. 3a).
Um esquema mostrando a duplicação translocada do cromossoma 2 numa estirpe de A. oryzae. Uma região doadora alvo 1.4-Mb do cromossoma 2 foi duplicada e translocada para a região receptora do cromossoma 4 usando replicação induzida por quebra
a Confirmação da duplicação translocada por PCR. A duplicação translocada orientada de uma região de 1,4-Mb do cromossoma 2 para o cromossoma 4 foi confirmada por PCR. Pista 1. B-U, B-L; Pista 2. ct166-U, ct166-L; Pista 3. B-U, ct166-L; Pista 4. ct166-U, B-L (Pistas 1-4. estirpe de duplicação translocada J4); Pista 5. B-U, B-L; Pista 6. ct166-U, ct166-L; Pista 7. B-U, ct166-L; Pista 8. ct166-U, B-L (Pistas 5-8. Estirpe do tipo selvagem). b Confirmação da duplicação translocada por matrizes de hibridação comparativa do genoma (CGH). As barras verticais mostram rácios de intensidade de sinal para as sondas da estirpe que suporta a duplicação translocada (J4) relativamente às da estirpe de controlo (RIB40). As relações dos sinais de hibridação na região 1.4-Mb do cromossoma 2 foram o dobro das da outra região, indicando que a região 1380-kb do cromossoma 2, incluindo AO090002001035 a AO090002001558, foi duplicada. A proporção de sinais de hibridização na região de 308-kb do cromossoma 4 foi quase zero, indicando que a região de 308-kb do cromossoma 4, incluindo AO090166000010 a AO090166000123, foi apagado
Detectámos a amplificação do fragmento de ADN de 5-kb utilizando combinações de iniciadores que visam a posição translocada (iniciadores ct166-U e B-L na pista 4 da Fig. 4. 3a) e posição original (primários B-U e B-L na faixa 1 da Fig. 3a) na estirpe regenerada. Em contraste, a amplificação do fragmento de 3kb só foi detectada utilizando a combinação de primários correspondente à posição original (primários B-U e B-L na faixa 5 da Fig. 3a, e primários ct166-U e ct166-L na faixa 6 da Fig. 3a) na estirpe de controlo (RIB40). Estas análises confirmaram que a duplicação translocada da região cromossómica alvo ocorreu na estirpe regenerada; esta estirpe foi posteriormente referida como J4 e utilizada em análises posteriores.
Como descrito acima, gerando múltiplas duplicações cromossómicas translocadas é teoricamente possível. Assim, construímos uma estirpe na qual a região alvo do cromossoma 2 foi triplicada, e avaliámos os efeitos da triplicação no fenótipo desta estirpe. Inicialmente, removemos o marcador pyrG na borda da região de duplicação translocada do cromossoma 4 por recombinação homóloga entre o cromossoma e o fragmento utilizado para remover o pyrG (Ficheiro adicional 1: Figura S3, topo). Os transformantes foram então seleccionados em placas de 1,2-M sorbitol-CZ contendo 5-FOA, e o vector para introdução do 3′ΔpyrG com a sequência de reconhecimento I-SceI foi integrado perto do fim do cromossoma 7 (Ficheiro adicional 1: Figura S3, região de aceitação). Seguiu-se uma selecção utilizando 5-FOA. A estirpe parental resultante contendo a triplicação (K1-IF5-2-5FOA) foi cultivada, e foram preparados protóplastos para análises fenotípicas. Os protoplastos foram tratados com I-SceI e PEG, tal como descrito acima. Após incubação durante 3 semanas a 30 °C, as colónias regeneradas foram analisadas por PCR. Após isolamento de uma única colónia (os detalhes são descritos no ficheiro adicional 1: Fig. S4), a estirpe contendo núcleos homocarióticos com os cromossomas translocados foi posteriormente referida como estirpe I-8.
Confirmação de duplicações cromossómicas translocadas utilizando hibridação genómica comparativa de matriz (matriz CGH)
CGH foi utilizada para confirmar a presença de duplicação cromossómica translocada na região cromossómica alvo. Em resumo, o ADN genómico isolado das estirpes RIB40 (controlo) e J4 (Δku70 estirpe com duplicação cromossómica translocada) foi rotulado com corantes Cy, hibridizado em lâminas de microarranjo a 65 °C durante 24 h, e digitalizado com um digitalizador laser. A comparação das duas estirpes revelou que a relação do sinal das sondas na região de 1,4-Mb do cromossoma 2 (AO090003001035-AO090003001558) era aproximadamente duas, e a das sondas localizadas na região de 308-kb perto da extremidade terminal do cromossoma 4 (AO090166000010-AO090166000123) era quase zero (Fig. 3b). Estas observações confirmaram a presença de duplicação translocada da região cromossómica alvo na estirpe J4 (Fig. 3b e ficheiro adicional 1: Figura S1). A estirpe BN1-1 (ku70 + estirpe com duplicação cromossómica translocada) foi também analisada usando CGH. Foram obtidos resultados semelhantes (ficheiro adicional 1: Figura S2), indicando que a duplicação translocada da região cromossómica alvo ocorreu com sucesso nas estirpes J4 e BN1-1.
Next, ADN genómico isolado das estirpes RIB40 (controlo) e I-8 (Δku70 estirpe com triplicação cromossómica translocada) foi rotulada com corantes Cy, hibridizada em lâminas de microarranjo, e digitalizada usando um scanner laser. Como mostrado na Fig. 4, comparações de estirpes triplicadas (I-8) e de controlo revelaram uma relação de sinal de aproximadamente 3 para as sondas localizadas na região 1,4-Mb do cromossoma 2 (AO090003001035-AO090003001558). Além disso, os rácios de sinal das sondas localizadas na região quase-telomérica 308-kb do cromossoma 4 (AO090166000010-AO090166000123) e na região quase-telomérica 13-kb do cromossoma 7 (AO090011000001-AO090011000008) foram quase nulos, indicando uma translocação bem sucedida do cromossoma 2 para o fim dos cromossomas 4 e 7 na estirpe I-8 (Fig. 4). Estes resultados indicam que múltiplas duplicações translocadas (como a triplicação translocada) da região dos cromossomas alvo foram conseguidas na estirpe I-8.
Confirmação da duplicação translocada por matriz CGH. Os resultados da matriz CGH indicam que a 1.4-Mb região do cromossoma 2 foi triplicada e translocada para as extremidades dos cromossomas 4 e 7
Análise da expressão do gene da duplicação e triplicação de cromossomas translocados em estirpes sólidas…state culture
Duplicação de grandes regiões cromossómicas pode upregular numerosos genes na região cromossómica duplicada e causar alterações fenotípicas através do efeito de dosagem de genes. Para demonstrar os efeitos da duplicação cromossómica na expressão genética, examinámos os níveis de expressão genética das estirpes em condições de fermentação em estado sólido. A estirpe J4 com uma duplicação translocada de uma região 1,4-Mb do cromossoma 2, estirpe I-8 com uma triplicação translocada da região 1,4-Mb do cromossoma 2, e a estirpe RIB40 (controlo) foram cultivadas durante 65 h a 30 °C em meio de farelo de trigo; depois, o RNA foi extraído e analisado por microarrays de expressão genética. As proporções de genes não-preparados nas regiões cromossómicas duplicadas eram notavelmente mais elevadas nas estirpes com cromossomas duplicados e triplicados. Como demonstrado nas Tabelas 1 e 2, a expressão génica foi aumentada em 11% em toda a região cromossómica (1293 vs. 12010). A expressão génica foi aumentada em 37 e 64% nas estirpes com regiões duplicadas (166 vs. 446) e triplicadas (284 vs. 446), respectivamente. Estes dados indicam que a duplicação segmentar e a triplicação das regiões cromossómicas alvo aumentaram efectivamente a transcrição dos genes residentes. Estes dados foram resumidos de acordo com a classificação de Clusters of Orthologous Groups (COGs) . Por classificações de COGs, o efeito da dosagem do gene de influência nos mecanismos de transdução de sinal (T) foi baixo com aumentos de 25% nas estirpes J4 (2 vs. 8) e 38% nas estirpes I-8 (3 vs. 8). A expressão dos genes categorizados no grupo do transporte e metabolismo dos nucleótidos (F), por classificação dos COGs, foi significativamente aumentada (5 vs. 5) na região duplicada das estirpes (Tabelas 1 e 2). Em contraste, a expressão dos genes foi reduzida em 4 e 2,5% nas regiões cromossómicas duplicadas (17 vs. 446) e triplicadas, respectivamente. Para os cromossomas da estirpe J4 (duplicada), foram identificados locais de genes não pregulados utilizando sondas (Ficheiro adicional 1: Figura S5), que mostraram claramente um aumento da transcrição de genes na região cromossómica duplicada. Aproximadamente 10% dos genes localizados fora da região duplicada (1127 vs. 11.564) foram upregulados; vários destes genes foram marcadamente upregulados na estirpe duplicada (Ficheiro adicional 1: Figura S5), indicando a presença de factores reguladores na região duplicada. Os genes upregulados na estirpe J4 estão resumidos nas Tabelas 3, 4, 5 e 6. Vinte e três genes proteolíticos, 8 genes amilolíticos, e 23 genes xilanolíticos, localizados fora da região duplicada, foram upregulados. Foi observada uma maior expressão de genes proteolíticos, localizados fora da região duplicada, na estirpe J4, sugerindo que o efeito de dosagem de genes exercido pela prtT ocorreu na região duplicada. Do mesmo modo, a expressão upregulada de genes amilolíticos indicou que o efeito de dosagem de genes, exercido pela amyR, ocorreu na região duplicada. A expressão de xlnR não foi aumentada. No entanto, observámos a expressão upregulada de genes relacionados com a xilanase, a maioria dos quais foram regulados positivamente pela xlnR . Isto indica que a xlnR2 (AO090003001292) afectou a expressão destes genes. A expressão de prtT, amyR, e xlnR2 foi upregulada na região duplicada (Tabela 6). Em contraste, 1252 genes localizados fora da região duplicada foram desregulamentados na estirpe J4, indicando que os genes envolvidos na regulação negativa também estavam presentes na região duplicada.
Atividade enzimática na duplicação e triplicação cromossómica translocada em culturas de estado sólido
Examinar como a duplicação e triplicação cromossómica afecta os fenótipos, avaliamos a actividade enzimática em estirpes de duplicação cromossomática translocada em condições de estado sólido. Mostrámos anteriormente um aumento da actividade de protease, amilase e carboxipeptidase ácida em estirpes com a região de 700-kb (AO090003001003-AO090003001258) da duplicação em tandem do cromossoma 2 em condições de cultivo em estado sólido em meio de farelo de trigo. Por conseguinte, medimos as actividades destas enzimas em estirpes de duplicação translocadas sob condições de cultivo em estado sólido (Fig. 5a). Tanto as duplicações cromossómicas translocadas (J4) como em tandem (700k-dup) levaram ao aumento da actividade da protease e da amilase. Além disso, a actividade da carboxipeptidase ácida na estirpe de duplicação translocada mostrou níveis ligeiramente superiores aos da estirpe do tipo selvagem (controlo RIB40), mas níveis inferiores aos da estirpe de duplicação em tandem. Uma lista de genes localizados na região sobreposta entre J4 e 700k-dup é fornecida no ficheiro adicional 1: Tabela S2. Examinámos então a actividade enzimática na estirpe de triplicação I-8 em condições de cultura em estado sólido. A actividade da protease foi aumentada mais de quatro vezes na estirpe de triplicação (I-8) em comparação com a da estirpe de controlo (RIB40), e foi superior às das estirpes translocadas e de duplicação em tandem (J4 e 700k-dup) (Fig. 5a). A actividade da amilase foi também maior na estirpe de triplicação (I-8) do que nas estirpes de duplicação (J4 e 700k-dup), indicando que a dosagem do gene mostrou efeitos fenotípicos aumentados após a duplicação múltipla da região cromossómica. A estirpe BP-B3, uma estirpe de duplicação em tandem com uma região de 9-kb (AO090003001033-AO090003001036) que incluía alp (proteína alcalina codificadora do gene, AO090003001036), mostrou um aumento de 1,7 vezes na actividade da protease em comparação com a da estirpe de controlo (Fig. 5a). A expressão de alp e prtT nas estirpes de duplicação foi examinada por PCR em tempo real (Tabela 7).
>
Expressamos então o factor de transcrição prtT e examinámos os seus efeitos em estirpes de translocação cromossómica duplicadas e triplicadas. A PrtT regula enzimas proteolíticas em A. oryzae . Os nossos microarrays de expressão genética revelaram aumentos moderados de cinco vezes na expressão da prtT em estirpes de duplicação. Estes dados sugerem que a prtT é limitadora da taxa, indicando um aumento da actividade protease nas estirpes de prtT em sobre-expressão. O pAPRT do vector de sobreexpressão prtT contém um promotor e terminador amyB, ligado à estrutura de leitura aberta do gene prtT, e um marcador pyrG. pAPRT em estado circular foi utilizado para transformar a estirpe RP1 (estirpe de eliminação pyrG), del 1546K4 (estirpe de eliminação pyrG derivada da estirpe J4), e TLTAs11B (estirpe de eliminação pyrG derivada da estirpe I-8). Para cada estirpe de sobreexpressão prtT, foram seleccionados transformadores únicos mostrando grandes halos claros em placas de caseína, o que indica uma elevada actividade de protease; a sobreexpressão da prtT foi confirmada por PCR em tempo real (Tabela 8).
A expressão da prtT foi aumentada mais de 10 vezes no APRT, 1546 estirpes K-APRT, e TLTA-APRT em comparação com a estirpe de controlo (Tabela 8). Consequentemente, a actividade da protease em culturas de estado sólido (Fig. 5a) foi aproximadamente três vezes mais elevada na estirpe transformada por APRT do que na estirpe RIB40 (tipo selvagem). Isto indica que uma única cópia de alp foi limitadora da taxa de actividade da protease sob condição de sobreexpressão da prtT. Além disso, a actividade da protease foi semelhante nas estirpes 1546 K-APRT e TLTA-APRT e quase seis vezes superior à da estirpe RIB40; isto indica que duas cópias de alp foram suficientes para a actividade da protease quando a prtT foi sobreexpressa.
As estirpes APRT, 1546 K-APRT, e TLTA-APRT mostraram aumentos semelhantes na actividade da carboxipeptidase ácida em comparação com a da estirpe RIB40. Isto sugere que os genes da carboxipeptidase ácida são transaccionados pela prtT, mas não estão localizados na região cromossómica duplicada. A integração monocópia do pAPRT nas estirpes APRT e TLTA-APRT, e a integração bicópia do pAPRT na estirpe 1546 K-APRT, foram confirmadas por PCR quantitativa (ficheiro adicional 1: Figura S7).
Os fenótipos de crescimento das estirpes de duplicação translocada nas placas CZ são apresentados na Fig. 5b. As estirpes foram cultivadas em placas de 1,2 M de sorbitol-CZ a 30 °C durante 7 dias. A estirpe J4 mostrou um ligeiro atraso no crescimento em comparação com o crescimento da estirpe RIB40. A estirpe I-8 mostrou um ligeiro atraso no crescimento em comparação com a da estirpe J4. A taxa de crescimento das estirpes diminuiu gradualmente à medida que o número de cópias da região duplicada do cromossoma 2 aumentava. A eliminação de uma região de 308-kb do cromossoma 4, resultante da translocação nas estirpes J4 e I-8, pode ter causado o atraso no crescimento. As taxas de crescimento das estirpes APRT e 1546 K-APRT foram semelhantes às das estirpes RIB40 e J4, respectivamente. Contudo, a estirpe TLTA-APRT mostrou um grave atraso no crescimento em comparação com a estirpe I-8. Como mostra a tabela 8, a expressão de alp era extremamente elevada na estirpe TLTA-APRT em comparação com a das estirpes APRT ou 1546 estirpes K-APRT. A expressão de alp era originalmente elevada na estirpe de controlo (RIB40), sugerindo que o aumento da expressão de alp causou atrasos de crescimento na estirpe TLTA-APRT.