INTEGRADOS EM MODELOS VITRO PARA ESTUDAR A INFLUÊNCIA DAS CÉLULAS ENDOTÉLICOS SOBRE O TRÁFEGO E DESENVOLVIMENTO DE CD -METODOLOGIA
Claramente, ainda é necessário muito trabalho para compreender os detalhes moleculares e as consequências biológicas das interacções entre as CD e o endotélio. Uma limitação ao progresso neste campo é a falta de uma ampla utilização dos sistemas de cultura endotelial. Além disso, não existe até agora nenhuma fonte de endotélio linfático humano ou murino cultivado. A identificação de vários marcadores moleculares limitados ao endotélio linfático, incluindo o desmoplakin (Schmelz et al., 1994), o receptor VEGF-C Flt-4 (Kaipainen et al., 1995), LYVE-1 (Banerji et al., 1999) e Prox-1 (Wigle e Oliver, 1999), deverá facilitar o estabelecimento do endotélio linfático de cultura. Aqui, são discutidos métodos algo semelhantes e bem caracterizados que utilizam monocamadas HUVEC para estudar a transmigração inversa. Um sistema modelo revisto que incorpora duas monocamadas endoteliais, uma de origem linfática se possível, seria o mais ideal.
Figuras 21.2 e 21.3 ilustram esquematicamente dois sistemas de cultura integrados que permitem o estudo da migração transendotelial apical para basal, diferenciação, e transmigração inversa de volta através da mesma monocamada endotelial. As células endoteliais isoladas de veias umbilicais (Jaffe et al., 1973) e cultivadas em 20% soro humano ou soro fetal bovino sem factores de crescimento adicionais são semeadas em matriz amniótica humana (Furie et al., 1984; Huang et al., 1988) ou numa matriz reconstituída de colagénio tipo I (Muller et al., 1989) dentro de uma a duas passagens do chapeamento primário (Figura 21.2). A sementeira de endotélio em géis de colagénio reconstituído é mais eficiente se a matriz de colagénio for revestida com fibronectina imediatamente antes da adição de células endoteliais. Em contraste, o crescimento do endotélio sobre o âmnio, uma matriz extracelular humana nativa composta predominantemente de colagénio tipo I e III (Lwebuga-Mukasa et al., 1984) e provavelmente outros componentes da matriz, não requer a adição de fibronectina exógena. Assim, uma vantagem para este último sistema é que é bastante simples preparar culturas sem LPS, evitando o uso de fontes comerciais de componentes de matriz extracelular, em que os níveis de LPS variam de lote para lote. Outra característica do modelo HUVEC/amnion é que as soluções de tipo, tais como quimiotractantes (Huang et al.., 1988), ou volumes de meio (Randolph e Furie, 1995) que banham a superfície basal das culturas podem ser controlados ou modificados a qualquer momento como desejado, enquanto o aspecto basal das culturas utilizando colagénio reconstituído é fechado e relativamente inacessível à manipulação (Figura 21.2).
P>Pesar contra estas desvantagens, o sistema de colagénio reconstituído tem uma série de vantagens, incluindo uma configuração menos trabalhosa e uma maior reprodutibilidade entre réplicas, uma vez que a espessura do âmnio pode variar um pouco entre réplicas. A principal vantagem do modelo de gel de colagénio reconstituído é a possibilidade de incorporar partículas na matriz (Figura 21.3), uma vez que as partículas fagocitárias aumentam a diferenciação dos monócitos em DCs.
Em ambos os sistemas modelo, os monócitos e outros precursores de DC que são adicionados ao aspecto apical das culturas migram através do endotélio não estimulado (Figura 21.3). Um bom método fisiologicamente relevante para determinar que o endotélio é verdadeiramente não estimulado e que o sistema é livre de LPS é adicionar neutrófilos a alguns poços de controlo, uma vez que estas células não migram através de monocamadas endoteliais em repouso, mas migram facilmente através do endotélio estimulado (Huang et al.., 1988; Furie e McHugh, 1989).
Para estudar a transmigração inversa (Figura 21.3; ver métodos em Randolph e Furie, 1996; Randolph et al., 1998a, 1998b), o endotélio deve ser lavado em meio após os monócitos terem sido incubados com as monocamadas durante um tempo suficiente para permitir a transmigração máxima para a matriz subjacente (1-2 horas). Esta etapa de lavagem remove as células que não aderiram ou aderiram frouxamente ao endotélio durante a incubação. Essencialmente, as células que não aderiram ao endotélio migram facilmente para a matriz subendotelial (Muller e Weigl, 1992; Meerschaert e Furie, 1994). Tipicamente, o meio de cultura repleto (como Medium 199) remove eficazmente as células não aderentes do compartimento apical, mas uma técnica mais rigorosa pode ser utilizada na qual o endotélio é brevemente lavado com tampão livre de Ca2+- e Mg2+ contendo 1 mmol/L EGTA para perturbar as interacções integrina-liga. Em seguida, adiciona-se um meio de cultura completo e a incubação continua para durações suficientes para permitir a transmigração inversa (Figura 21.4). Os dois sistemas de cultura diferem ligeiramente no intervalo da transmigração inversa: entre 24 e 36 horas nas culturas de amniões (Randolph e Furie, 1996) e cerca de 48 horas nas culturas de colagénio reconstituídas (Randolph et al., 1998b). A recuperação de células transmigradas inversamente (por simples pipetagem a partir do compartimento apical, conforme detalhado em Randolph et al., 1998b) é mais eficiente no modelo de gel de colagénio reconstituído quando é instalado em poços de microtitulação, provavelmente devido a uma geometria mais favorável. Se estabelecido como descrito, são recuperadas cerca de 15 000 células de transmissão inversa por poço de microtitulação (Randolph et al., 1998a, 1998b).