Existem actualmente vários métodos de etiquetagem para rastrear biomoléculas. Alguns dos métodos incluem o seguinte.
Marcadores isotópicosEditar
Espécies comuns que os marcadores isotópicos são utilizados para incluir proteínas. Neste caso, os aminoácidos com isótopos estáveis de carbono, azoto ou hidrogénio são incorporados em sequências de polipeptídeos. Estes polipéptidos são depois submetidos a espectrometria de massa. Devido à alteração exactamente definida em que estes isótopos incorrem nos peptídeos, é possível dizer através do gráfico de espectrometria quais os peptídeos que continham os isótopos. Ao fazê-lo, é possível extrair a proteína de interesse de vários outros num grupo. Os compostos isotópicos desempenham um papel importante como fotocromos, descritos abaixo.
Biossensores colorimétricosEdit
Biossensores estão ligados a uma substância de interesse. Normalmente, esta substância não seria capaz de absorver a luz, mas com o biosensor ligado, a luz pode ser absorvida e emitida num espectrofotómetro. Além disso, os biossensores que são fluorescentes podem ser vistos a olho nu. Alguns biosensores fluorescentes também têm a capacidade de mudar de cor em ambientes em mudança (ex: de azul para vermelho). Um investigador seria capaz de inspeccionar e obter dados sobre o ambiente circundante com base na cor que poderia ver visivelmente da espécie híbrida biosensor-molécula.
Os ensaios colorimétricos são normalmente utilizados para determinar a concentração de uma espécie em relação a outra.
Compostos fotocrómicosEditar
Os compostos fotocrómicos têm a capacidade de mudar entre uma gama ou variedade de cores. A sua capacidade de mostrar cores diferentes reside na forma como absorvem a luz. As diferentes manifestações isoméricas da molécula absorvem diferentes comprimentos de onda de luz, de modo que cada espécie isomérica pode exibir uma cor diferente com base na sua absorção. Estas incluem os compostos foto-interruptíveis, que são proteínas que podem mudar de um estado não fluorescente para o de um fluorescente dado um determinado ambiente.
A molécula orgânica mais comum a ser usada como foto-cromo é o diarileteno. Outros exemplos de proteínas fotocromáveis incluem PADRON-C, rs-FastLIME-s e bs-DRONPA-s, que podem ser utilizadas tanto em células de plantas como de mamíferos para observar células a moverem-se para ambientes diferentes.
BiomateriaisEditar
Biomateriais fluorescentes são uma forma possível de utilizar factores externos para observar um caminho de forma mais visível. O método envolve rotular fluorescentemente moléculas peptídeas que alterariam o percurso natural de um organismo. Quando este peptídeo é inserido na célula do organismo, ele pode induzir uma reacção diferente. Este método pode ser utilizado, por exemplo, para tratar um paciente e depois ver visivelmente o resultado do tratamento.
Sensores electroquímicosEdit
Sensores electroquímicos podem ser utilizados para a detecção sem rótulos de biomoléculas. Detectam alterações e medem a corrente entre um eléctrodo metálico sondado e um electrólito contendo o analito alvo. Um potencial conhecido para o eléctrodo é então aplicado a partir de uma corrente de feedback e a corrente resultante pode ser medida. Por exemplo, uma técnica que utiliza a detecção electroquímica inclui o aumento lento da tensão causando a oxidação ou redução de espécies químicas no eléctrodo. A corrente celular versus voltagem é traçada, o que pode, em última análise, identificar a quantidade de espécies químicas consumidas ou produzidas no eléctrodo. As etiquetas fluorescentes podem ser utilizadas em conjunto com sensores electroquímicos para facilitar a detecção num sistema biológico.
Etiquetas fluorescentesEdit
Aequorea victoria
Estrutura de GFP
Dos vários métodos de etiquetagem de biomoléculas, As etiquetas fluorescentes são vantajosas na medida em que são altamente sensíveis mesmo em baixa concentração e não destrutivas para a molécula alvo, dobráveis e funcionais.
Proteína fluorescente verde é uma proteína fluorescente natural da medusa Aequorea victoria que é amplamente utilizada para marcar as proteínas de interesse. A GFP emite um fóton na região verde do espectro luminoso quando excitada pela absorção da luz. O cromóforo consiste de um tripé oxidado -Ser^65-Tyr^66-Gly^67 localizado dentro de um barril β. A GFP catalisa a oxidação e só necessita de oxigénio molecular. A GFP foi modificada através da alteração do comprimento de onda da luz absorvida para incluir outras cores de fluorescência. YFP ou proteína fluorescente amarela, BFP ou proteína fluorescente azul, e CFP ou proteína fluorescente ciano são exemplos de variantes de GFP. Estas variantes são produzidas pela engenharia genética do gene GFP.
Sondas fluorescentes sintéticas também podem ser usadas como etiquetas fluorescentes. As vantagens destas etiquetas incluem um tamanho menor com mais variedade na cor. Podem ser usadas para etiquetar proteínas de interesse de forma mais selectiva através de vários métodos, incluindo a etiquetagem baseada no reconhecimento químico, tais como a utilização de etiquetas com peptídeos metálicos, e a etiquetagem baseada no reconhecimento biológico, utilizando reacções enzimáticas. Contudo, apesar da sua vasta gama de comprimentos de onda de excitação e emissão, bem como melhor estabilidade, as sondas sintéticas tendem a ser tóxicas para a célula e por isso não são geralmente utilizadas em estudos de imagem celular.
Etiquetas fluorescentes podem ser hibridizadas para mRNA para ajudar a visualizar a interacção e actividade, tais como a localização do mRNA. Um fio antisense rotulado com a sonda fluorescente é ligado a um único fio de mRNA, e pode então ser visto durante o desenvolvimento celular para ver o movimento do mRNA dentro da célula.
Etiquetas fluorogénicasEditar
Um fluorogénio é um ligando (ligando fluorogénico) que não é em si mesmo fluorescente, mas quando é ligado por uma proteína específica ou estrutura de RNA torna-se fluorescente.
Por exemplo, FAST é uma variante da proteína amarela fotoactiva que foi concebida para ligar mímicas químicas do cromóforo de tripéptido GFP. Do mesmo modo, o aptamer de espinafre é uma sequência de RNA concebida que pode ligar mímicas químicas do cromóforo GFP, conferindo assim fluorescência condicional e reversível às moléculas de RNA que contêm a sequência.