Abstract
Hipertrofia do Ligamentum flavum (LF) contribui para a estenose da coluna lombar (LSS) e é causada principalmente pela fibrose. Dados recentes indicam que a miR-155 desempenha um papel crucial na patogénese de diferentes doenças fibróticas. Este estudo visava testar a hipótese de que a miR-155 exerce efeitos sobre a espessura do LF regulando a expressão do colagénio. Verificámos que a espessura do LF e a expressão do colagénio I e, colagénio III eram mais elevados no LF de pacientes com LSS do que no LF de pacientes com hérnia de disco lombar (LDH) (). A expressão de miR-155 foi significativamente mais elevada em LF do grupo LSS do que em LF do grupo LDH (). o nível miR-155 foi positivamente correlacionado com a espessura LF (, ), o nível de colagénio tipo I (, ), e o nível de colagénio tipo III (, ). miR-155 imitou um aumento da expressão de mRNA e proteína de colagénio I e colagénio III em fibroblastos isolados de LF, enquanto que a esponja miR-155 diminuiu a expressão de mRNA e proteína de colagénio I e III em fibroblastos. Em conclusões, miR-155 é um miRNA associado à fibrose e pode desempenhar um papel importante na patogénese da hipertrofia do LF.
1. Introdução
Estenose espinal lombar (ELA) é uma condição comum em doentes idosos. A LSS é definida como o estreitamento do canal raquidiano com impacto na medula ou raiz nervosa que resulta nos sintomas de radiculopatia ou pseudoclaudicação . A hipertrofia do ligamentum flavum (LF) está geralmente envolvida na patogénese do LSS, que pode reduzir o diâmetro do canal espinhal e comprimir o saco dural e as raízes nervosas, resultando em sintomas, mesmo na ausência de um anel protuberante fibroso ou hérnia de núcleo pulposo ou esporas ósseas .
LF é uma estrutura elástica bem definida que consiste em fibras elásticas (80%) e de colagénio (20%). Os tecidos hipertrofiados de LF tornam-se desorganizados e apresentam níveis diminuídos e degenerescentes de fibras elásticas, mas níveis aumentados de fibras de colagénio . Durante a hipertrofia do LF, há aumentos na expressão e actividade de várias moléculas, incluindo as metaloproteases de matriz (MMPs) , inibidores de tecido das metaloproteases de matriz (TIMPs) , factor de crescimento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) , factor de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) , proteína morfogenética óssea (BMP) , e citocinas inflamatórias .
microRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA não codificantes de 19-24 nucleotídeos que controlam a expressão genética a nível pós-transcritivo, conservadas de forma evolutiva. as assinaturas de expressão do miRNA têm sido associadas a características clinicopatológicas e aos resultados de diferentes doenças . Contudo, sabe-se muito pouco sobre o papel dos miRNAs na hipertrofia do LF. miRNAs desempenham um papel crucial na degradação e fibrose dos tecidos . miRNAs poderiam promover a degradação da cartilagem através da regulação da expressão de genes que codificam factores catabólicos, tais como MMP e ADAMTS . Notavelmente, foi observado um aumento significativo na expressão de miR-155 em células fibroblásticas e tecidos de pacientes com artrite reumatóide . MiR-155 é um típico miRNA multifuncional que desempenha um papel crucial em vários processos fisiológicos e patológicos, tais como diferenciação de linhagem hematopoiética, imunidade, cancro, doença cardiovascular, e resposta inflamatória .
Neste estudo, procurámos explorar o papel potencial de miR-155 no desenvolvimento da hipertrofia de LF em pacientes com LSS. Comparámos a espessura, degradação da elastina, fibrose, expressão de colagénio I e colagénio III, e expressão de miR-155 em LF de pacientes com LSS com os de pacientes com hérnia de disco lombar (LDH). Em seguida, investigámos a correlação entre o nível miR-155 e as características do LF. Finalmente, examinámos os efeitos de miR-155 na expressão de colagénio dos tipos I e III em células LF humanas cultivadas.
2. Métodos
2.1. Espécimes
amostras de LF foram obtidas de 15 pacientes (7 homens, 8 mulheres, idade média: 65,67 anos, intervalo: 63-71 anos) que foram submetidos a laminectomia descompressiva devido a estenose espinal sintomática degenerativa da madeira. Como controlo, foram obtidas amostras de LF de 15 doentes (10 homens, 5 mulheres, idade média: 25,17 anos, intervalo: 20-30 anos) com hérnia de disco lombar que foram tratados operativamente para esta doença. As LF foram amostradas a partir de L4/5 e depois submetidas a coloração histológica, coloração tricrómica de Masson, análise imuno-histoquímica e avaliação biológica. O estudo foi aprovado pela comissão de análise ética institucional com consentimento informado por escrito obtido de cada paciente.
2.2. Medição da espessura do LF
Ressonância magnética (MRI) foi realizada para medir a espessura do LF em cada um dos 30 pacientes. Na imagem axial ponderada em T1 através da articulação da faceta, o LF foi claramente observado como uma massa de baixa intensidade de sinal apenas no lado ventral da articulação da faceta. A espessura máxima do LF foi traçada utilizando a técnica do cursor manual por um cirurgião experiente e medida automaticamente no sistema PACS. A medição de cada ligamento foi repetida três vezes, e o valor médio foi utilizado como espessura final de LF.
2,3. Análise Histológica
Espécimes foram cortados sagitalmente, fixados em formalina a 10% durante 48 h, e embutidos num bloco de parafina. Secções com corte fino (4 μm) foram preparadas e coradas por hematoxilina e eosina (H&E) coloração e tricromação de Masson por um patologista experiente que não conhecia as origens das amostras. H&E a coloração revelou a morfologia e estrutura do LF e o grau de degradação da elastina. A coloração tricrómica de Masson foi utilizada para identificar a fibra elástica (rosa) e a fibra de colagénio (azul) e para determinar o grau de fibrose .
2,4. PCR em Tempo Real
RNA total foi isolado a partir de amostras ou células usando TRIZOL (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Para medir os níveis de expressão do mRNA de colagénio dos tipos I e III, o cDNA foi transcrito de forma inversa a partir do RNA isolado, incubando 500 ng de RNA tratado com DNase com um kit de síntese de primeira linha (Biotecnologias Avançadas). A PCR em tempo real foi realizada utilizando o corante verde SYBR num termociclador com os seguintes parâmetros: 40 ciclos, 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 20 segundos, e 72°C durante 15 segundos. Para medir o nível de miR-155, a RT-PCR foi realizada com o Kit de Detecção All-in-One miRNA qRT-PCR (Tiangen). Foram utilizados os seguintes primários: colagénio I forward: 5′-GTGCGATGATGACGTGATCTGTGA-3′, reverse: 5′-CGGGTGGTTTCTTGGGTCGGT-3′; colagénio III para a frente: 5′-GCCAAATGTGTGTCTGTGACTCA-3′ e para trás: 5′-GGGGCGGAGTAGGGCAGTTG-3′; miR-155 forward TTAATGCTAATCGTGGGGTGGT. Todos os primários foram sintetizados pela Shenggong Inc. Todos os dados foram analisados utilizando o método comparativo ΔΔCT para calcular a diferença entre os valores do ciclo de limiar (CT) dos genes alvo e de referência em cada amostra.
2,5. Western Blot Analysis
Espécimes de tecido e células cultivadas foram lisados em tampão RIPA contendo cocktail inibidor de protease. Quantidades equivalentes de proteína foram separadas por electroforese e transferidas para uma Membrana de Transferência Immobilon-P (Millipore). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite sem gordura em soro fisiológico Tris-buffered e depois incubadas com anticorpos monoclonais Col 1 ou Col 3 (Abcam, EUA), seguido de incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano silvestre (Abcam, EUA). Actin (Abcam, EUA) foi utilizado como controlo de carga.
2.6. Cultura primária de células fibroblastadas LF
As amostras LF foram obtidas assepticamente de seis pacientes jovens submetidos a cirurgia à coluna vertebral. As amostras dissecadas foram picadas em pequenos pedaços e digeridas em meio sem soro (Gibco) contendo 250 U/mL de colagenase tipo I (Sigma) a 37°C, numa atmosfera contendo 5% de CO2. Os espécimes digeridos foram lavados com meio contendo soro para inibir a actividade da colagenase e depois colocados em pratos de 35 mm no meio modificado de Dulbecco Eagle Medium e Ham’s F-12 medium (DMEM/F12, Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino activado pelo calor (FBS, Gibco-BRL). As culturas foram incubadas a 37°C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2. O meio era mudado de dois em dois dias. Após duas semanas, as células começaram a migrar dos chips ligamentares e formaram uma monocamada. As células foram mantidas durante duas a três semanas em DMEM/F12 contendo 10% FBS, 1% v/v de penicilina, e estreptomicina (Sigma) numa incubadora com atmosfera humidificada contendo 5% de CO2. Os níveis de expressão proteica do colagénio dos tipos I e III foram detectados por imunocitoquímica, como descrito anteriormente .
2,7. Construção Vectorial
hsa-miR-155 sequência precursora foi obtida de miRBase (http://www.mirbase.org/): CTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGTTTTTGCCTCCAACTGCCTACATTAGCATTAGCATTAACAG. a sequência hsa-miR-155 foi UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGU, e a sequência de ADN complementar foi ACCCCTATCACAATTAGCATTAAA. As esponjas miR-155 foram concebidas como três sequências complementares incompletas. Os oligoelementos foram clonados em pCDH-GFP para fazer pCDH-miR-155 ou pCDH-miR-155-sponge plasmid.
2.8. Embalagem e Infecção por Lentivírus
Para a transfecção, 293T células foram cultivadas a 37°C numa incubadora de 5% de CO2 até as células atingirem 70-80% de confluência, e as células monocamada foram transfectadas com PCDH-GFP, pCDH-miR-155, ou pCDH-miR-155-sponge plasmid misturado com psPAX2 e pMD usando lipossomas. O meio de cultura foi descartado após 4 h, e as células foram lavadas 3 vezes com PBS. Finalmente, 15 mL de meio de cultura celular contendo 10% de soro fetal bovino foram adicionados e as células foram cultivadas durante 24 h. Depois, os sobrenadantes contendo GFP (grupo branco), miR-155 (grupo OE), ou esponja miR-155 (grupo esponja) lentivírus foram recolhidos e utilizados para infectar células fibroblásticas. Outro lentivírus contendo um miRNA absurdo foi utilizado como controlo (grupo CON).
2.9. Análise estatística
Dados foram expressos como a média ± SD e analisados usando o pacote de análise estatística SPSS versão 12 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). As medições da espessura do LF foram comparadas utilizando o teste t de aluno. As diferenças nos níveis de colagénio I, colagénio III, mRNA, e expressão de proteínas e nível miR-155 entre grupos foram avaliadas por ANOVA unidireccional. As correlações entre a espessura LF, colagénio I, colagénio III, e níveis miR-155 foram analisadas usando o método Spearman. foi considerado estatisticamente significativo.
3. Resultados
3.1. Espessura do LF
A espessura da porção média do LF foi medida. A espessura média do LF foi 2,8 ± 0,7 mm (intervalo: 1,63-3,87 mm) no grupo LDH e 5,3 ± 1,0 mm (intervalo: 3,95-7,48 mm) no grupo LSS. Esta diferença foi significativa ().
3.2. Degradação da elastina e Fibrose de LF
Análise histológica mostrou que a área de fibras elásticas diminuiu e a área de colagénio aumentou em LF do grupo LSS, em comparação com o grupo LDH. No grupo LDH, as fibras elásticas ricas foram ordenadas em paralelo (Figuras 1(a) e 1(b)). No entanto, no grupo LSS, as fibras elásticas foram fragmentadas, desorganizadas, e perdidas focalmente, acompanhadas pela proliferação de fibras de colagénio (Figuras 1(c) e 1(d)). A coloração tricrómica de Masson mostrou que, em LF do grupo LDH, uma grande área foi corada de rosa e mostrou uma disposição regular, indicando uma condição nãofibrótica normal (Figuras 1(e) e 1(f)), mas em LF, do grupo LSS, uma grande área foi corada de azul, indicando a presença de fibrose maciça (Figuras 1(g) e 1(h)).
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3.3. Expressão dos colágenos I e III em LF
Os níveis de expressão do mRNA de ambos os colágenos I e III foram aumentados significativamente em amostras de LF do grupo LSS (Figura 2(a)). A expressão das proteínas dos colágenos I e III é maior em amostras de LF do grupo LSS do que do grupo LDH (Figuras 2(b) e 2(c)).
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br>(c) 3.4. miR-155 Nível em LF
O nível médio de miR-155 foi 1.1748 ± 0,047 (intervalo: 1,1278-1,2218) no grupo LDH e 5,1081 ± 0,703 (intervalo: 4,4051-5,8111) no grupo LSS. O nível miR-155 foi significativamente mais elevado nas amostras LF do grupo LSS do que nas do grupo LDH (, Figura 3(a)). A análise de correlação mostrou que o nível miR-155 aumentou em paralelo com a espessura do LF, mostrando uma correlação positiva e significativa. O coeficiente de regressão foi de 0,958 (Figura 3(b)). Além disso, a expressão do colagénio dos tipos I e III mostrou uma correlação positiva e significativa com o nível miR-155 em LF (Figura 3(c)). Os coeficientes de regressão foram de 0,827 () e 0,825 () para o colagénio dos tipos I e III, respectivamente.
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br>(c) (a)
br>(b)(c)
3,5. miR-155 Upregula a expressão de colagénio I e III em LF Fibroblastos
Para determinar o papel de miR-155 na regulação da expressão de colagénio dos tipos I e III em LF, isolámos os fibroblastos de LF e infectámo-los com lentivírus. A análise RT-PCR mostrou que a expressão de mRNA do colagénio dos tipos I e III foi aumentada nas células infectadas com miR-155 imitam lentivírus em comparação com os controlos (Figura 4(a)). A análise Western blot mostrou que a expressão proteica do colagénio dos tipos I e III foi aumentada em células infectadas com lentivírus mímico miR-155 em comparação com os controlos (Figuras 4(b) e 4(c)). A imunocitoquímica confirmou que a coloração do colagénio dos tipos I e III era obviamente mais forte nas células infectadas com o lentivírus mímico miR-155 em comparação com os controlos (Figuras 4(d)-4(g)).
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Em contraste, a expressão do mRNA do colagénio dos tipos I e III foi diminuída nas células infectadas com o lentivírus esponjoso miR-155 em comparação com os controlos (Figura 5(a)). Consistentemente, a análise Western blot mostrou que a expressão proteica do colagénio dos tipos I e III foi diminuída nas células infectadas com o lentivírus esponjoso miR-155 em comparação com os controlos (Figuras 5(b) e 5(c)). A imunocitoquímica confirmou que a coloração do colagénio dos tipos I e III era mais fraca nas células infectadas com o lentivírus esponjoso miR-155 em comparação com os controlos (Figuras 5(d)-5(g)).
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4. Discussão
LF contém alta concentração de elastina, permitindo a contracção durante a flexão e o alongamento durante a extensão . Sabe-se que a hipertrofia LF causa LSS, levando a dores lombares baixas . Neste estudo, descobrimos que a espessura média de LF no grupo LSS era significativamente maior do que a do grupo LDH. Também observámos uma disposição irregular, ruptura, inchaço, e diminuição das fibras elásticas, hialinização, e aumento do número de fibras de colagénio no grupo LF do grupo LSS. Além disso, constatámos que as fibras LF do grupo LSS apresentavam uma pontuação elevada de fibrose. Estes resultados são consistentes com estudos anteriores mostrando um aumento do conteúdo de colagénio (fibrose) e uma diminuição da relação elastina/colagénio em LF hipertrofiado .
Ao nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que descreve a relação entre a hipertrofia de LF e a expressão miRNA. Estudos recentes revelaram um papel importante do miR-155 na patogénese da osteoartrite e das doenças fibróticas. Aqui, concentrámo-nos no papel da miR-155 na patogénese da hipertrofia do LF. Descobrimos que a miR-155 foi significativamente upregulada no tecido LF de pacientes com LSS em comparação com pacientes com LDH. A análise de correlação mostrou que a expressão aumentada de miR-155 estava correlacionada com a espessura, a pontuação fibrótica, e a expressão de colagénio dos tipos I e III em LF. Além disso, isolámos fibroblastos de LF e mostrámos que a expressão de miR-155 upregulated a expressão de colagénio tipo I e tipo III nestas células.
Inflamação crónica é um factor de risco importante para a hipertrofia de LF. A progressão da hipertrofia de LF é acompanhada por um elevado grau de infiltração de macrófagos . Além disso, os macrófagos foram identificados como uma importante fonte celular de citocinas inflamatórias na hipertrofia do LF. Recentemente, o miR-155 foi identificado como um componente da resposta primária dos macrófagos a mediadores inflamatórios . Além disso, vários estudos demonstraram que o factor de crescimento transformador (TGF) está envolvido no processo de alterações hipertróficas durante a hipertrofia do LF . Curiosamente, miR-155 é um alvo directo da via TGF-/Smad, que induz a expressão miR-155 através de Smad4 . miR-155 contribui para a regulação da via TGF-/Smad ao visar directamente SMAD2 e SMAD5 . Estes resultados estabelecem uma forte ligação entre miR-155, via TGF-, e hipertrofia LF e indicam que miR-155 é um factor crítico que regula a fibroblast fibrose e a hipertrofia LF.
Existem várias limitações ao nosso estudo actual. Em primeiro lugar, o tamanho da nossa amostra foi limitado pela comissão de análise ética. Segundo, não pudemos recolher LF normal e em vez disso utilizámos espécimes de controlo de doentes com hérnias discais, cuja idade média era significativamente mais nova do que a dos doentes com estenose espinal. Por conseguinte, não podemos excluir a possibilidade de o envelhecimento poder ter um impacto na expressão de miR-155. Teria sido ideal ter dois controlos diferentes: a idade e o sexo de pacientes sem estenose e o sexo de pacientes com estenose tardia. O primeiro eliminaria a idade como uma variável independente, uma vez que nem todos os pacientes idosos desenvolvem estenose espinal. Pode ser que, tal como a aterosclerose, uma predisposição genética altere os factores bioquímicos que contribuem para a condição patológica. Espécimes de doentes tardios, que não têm quaisquer alterações degenerativas, permitiriam determinar a extensão das perturbações que ocorrem na estenose espinal. Infelizmente, estes dois controlos ideais raramente são submetidos a tratamento cirúrgico, tornando quase impossível recolher amostras suficientes de forma atempada. Assim, acabámos por nos conformar com os nossos actuais controlos. Embora reconhecidamente não sejam ideais, são razoáveis e adequados para testar a hipótese que postulámos neste estudo. De facto, nas literaturas sobre a hipertrofia ligamentum flavum, o grupo de hérnias discais jovens foi frequentemente utilizado como grupo de controlo .
5. Conclusões
Em resumo, descobrimos que miR-155 foi upregulada em pacientes com hipertrofia do ligamento lombar flavum. O nível de expressão de miR-155 foi correlacionado com a espessura e o grau de fibrose de LF. miR-155 aumentou a expressão de colagénio dos tipos I e III em fibroblastos de LF. Estes dados sugerem que miR-155 é um miRNA associado à fibrose e pode desempenhar um papel importante na patogénese da hipertrofia de LF.
Conflito de Interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses relativamente à publicação deste artigo.
Contribuição dos autores
Jianwei Chen e Zhanchun Li conceberam o estudo e escreveram o artigo. Jianwei Chen, Guibin Zhong, Lie Qian, Zhanchun Li, Zhiguang Qiao, Bin Chen, e Hantao Wang realizaram as experiências e analisaram os dados. Todos os autores leram e aprovaram o artigo final.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Zhiguang Qiao pelo seu trabalho preliminar para este estudo e agradecem ao Centro de Investigação Biomédica no Hospital Renji, Escola de Medicina, Universidade Jiaotong de Xangai, pela utilização de instrumentos. O estudo foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81370976) e pela Shanghai Natural Science Foundation, China (13zr1424900).