Real-time quantitative PCR, ou qPCR, é um método padrão para detectar e quantificar uma sequência alvo específica, ou para quantificar níveis de expressão genética numa amostra. Em qPCR, sondas fluorescentes ou ácidos nucleicos, ou corantes fluorescentes de dupla ligação de ADN são incorporados na reacção PCR e a formação do produto é monitorizada em tempo real após cada ciclo de PCR.
Probe-based qPCR usa um primário ou sonda fluorescente para detectar o produto de amplificação. Uma vantagem deste método é que permite a detecção específica da sequência do alvo e reduz a probabilidade de detecção de artefactos não específicos. A detecção baseada em sondas também pode acomodar a amplificação multiplex, utilizando sondas com rótulos diferentes. Existem várias abordagens diferentes à detecção baseada em sondas qPCR, incluindo sondas de hidrólise, tais como TaqMan®, sondas de hibridação, sondas de grampos capilares e primários rotulados.
A utilização de corantes de ligação de ADN fluorescentes, como BRYT® Green ou SYBR® Green, é uma das abordagens qPCR mais simples. Adiciona-se um corante à reacção, e a fluorescência é medida em cada ciclo de PCR. Uma vez que a fluorescência destes corantes aumenta dramaticamente na presença de ADN de cadeia dupla, a síntese de ADN pode ser monitorizada como um aumento do sinal fluorescente.
A saída primária de uma experiência de PCR em tempo real é uma curva de amplificação mostrando a acumulação do produto amplificado como sinal fluorescente versus o número do ciclo.
A quantificação da quantidade de material inicial é feita utilizando o ciclo de quantificação (Cq, também conhecido como Ct). Cq ou Ct (threshold cycle) é o ciclo de amplificação em que o sinal fluorescente detectado atinge um limiar de amplificação num poço específico. O limiar de amplificação é calculado com base na fluorescência de fundo sobre a região de base de todas as curvas do grupo e representa o ponto em que o sinal do repórter é significativamente mais elevado do que os níveis de fundo. Cq está inversamente relacionado com a quantidade de modelo inicial na reacção e é uma medida relativa da concentração do alvo na reacção PCR.