Platelet Glycoprotein IIb/IIIa Receptors and Glanzmann’s Thrombasthenia

L’aggregazione delle piastrine e la formazione di fibrina sono essenziali per il mantenimento della normale emostasi, un sistema progettato per agire rapidamente ed efficacemente per arrestare le emorragie. Questo sistema è anche innescato da eventi patogeni, come la rottura di una placca aterosclerotica, che può portare a vaso-occlusione trombotica, ischemia e infarto. Le piastrine sono uno dei principali responsabili di questi fenomeni trombotici dannosi e pericolosi per la vita a causa delle loro proprietà adesive, che comportano il rilascio di mediatori solubili, l’aggregazione piastrinica e l’aumento della generazione di trombina.1 Il recettore della glicoproteina IIb/IIIa delle piastrine (GPIIb/IIIa) è un componente chiave nel percorso di aggregazione piastrinica; di conseguenza, questo recettore è diventato il bersaglio dell’intervento terapeutico. Un paradigma di questa modalità di trattamento antipiastrinico si trova naturalmente nel disordine ereditario della trombastenia di Glanzmann. Una caratteristica chiave di questa malattia è che i pazienti presentano emorragie mucocutanee ma solo raramente dimostrano un’emorragia spontanea del sistema nervoso centrale,2 una complicanza temuta della terapia anticoagulante e antipiastrinica. Tutte le mutazioni che sono state identificate nei pazienti con trombastenia di Glanzmann risultano in una deficienza funzionale dei recettori GPIIb/IIIa,23 e un segno distintivo di questa malattia è l’assenza di aggregazione piastrinica indotta da agonisti. La caratterizzazione molecolare delle mutazioni che causano la trombastenia di Glanzmann ha fornito una ricchezza di informazioni sulle relazioni struttura-funzione del recettore GPIIb/IIIa. Questa revisione riassumerà brevemente le mutazioni che influenzano i domini di legame al ligando e l’attivazione del recettore e le presenterà nel contesto delle strutture previste. Una copertura più completa può essere trovata nelle recensioni che discutono la struttura e la funzione del complesso del recettore GPIIb/IIIa45 e la base clinica e molecolare della trombastenia di Glanzmann.23

Recettore GPIIb/IIIa

Le piastrine sono la prima linea di difesa nel prevenire la perdita di sangue dai vasi sanguigni danneggiati attraverso il riconoscimento e l’adesione ai componenti della matrice subendoteliale. Questo evento è seguito dalla formazione di un tappo piastrinico dovuto al reclutamento di ulteriori piastrine attraverso il legame e la reticolazione di grandi molecole ligandi, come il fibrinogeno e il fattore von Willebrand. Inoltre, le piastrine attivate forniscono una superficie per i componenti della coagulazione del sangue, facilitando così la generazione di trombina.67 L’aggregazione piastrinica è mediata dal recettore GPIIb/IIIa (integrina αIIbβ3), uno dei più abbondanti recettori della superficie cellulare (≈80 000 per piastrina),8 che rappresenta ≈15% della proteina di superficie totale.9 Sulle piastrine quiescenti, questo recettore mostra una minima affinità di legame per il fattore von Willebrand e il fibrinogeno plasmatico. In uno stato attivato, i meccanismi di trasduzione del segnale “inside-out “5 innescano un cambiamento conformazionale nel recettore in uno stato ad alta affinità di legame con il ligando, che è competente per legare glicoproteine adesive e formare un tappo piastrinico. Dopo il legame del ligando, i meccanismi di trasduzione del segnale “outside-in “5 mediano le interazioni integrina-citoscheletro. Questi hanno dimostrato di essere requisiti per gli eventi di occupazione post-legante, come la diffusione cellulare e la formazione di siti di adesione focale.10

I motivi di riconoscimento del ligando per i recettori integrinici richiedono un aminoacido acido per l’attività. Il primo esempio di un peptide acido che conferisce il riconoscimento dell’integrina è stata la sequenza Arg-Gly-Asp (RGD) nella fibronectina.11 Si è scoperto che altre molecole della matrice extracellulare contengono questa sequenza ed è stato adottato il concetto di RGD come motivo di riconoscimento comune.12 Il motivo RGD si trova nei ligandi dei recettori GPIIb/IIIa tra cui la catena α del fibrinogeno e il fattore von Willebrand, ma un motivo di riconoscimento Lys/Gly-Asp (K/GD), che si trova in un’unica sequenza dodecapeptidica nella catena γ del fibrinogeno, è necessario e sufficiente per l’aggregazione piastrinica mediata dal fibrinogeno.13

A causa dell’assenza di una struttura cristallina, sono disponibili informazioni meno precise riguardo ai siti all’interno dei recettori integrinici che riconoscono i ligandi. Le informazioni strutturali sono disponibili per 1 regione di legame ai ligandi, che è il dominio del fattore A o I di von Willebrand (inserito).14 Il dominio I è espresso da un sottoinsieme di subunità della catena α e la cristallografia ad alta risoluzione ha stabilito che questo dominio fa parte di un unico sito di coordinazione metallica designato come sito di adesione dipendente dagli ioni metallici (MIDAS).14 Il dominio I non è presente nella subunità GPIIb (αIIb), ma studi strutturali hanno identificato una regione con caratteristiche simili di legame ai cationi nelle subunità β di integrina.15 Un certo numero di modelli strutturali sono stati generati mostrando l’associazione conformazionale dei residui aminoacidici che si prevede abbiano un ruolo diretto nel legame con il ligando.161718

Un modello strutturale del dominio di legame con il ligando di una catena integrina α è stato predetto dalla modellazione al computer.19 La sequenza minima di legame con il ligando di GPIIb è composta dai 450 aminoacidi amino-terminali, che contengono 7 ripetizioni omologhe con 4 siti di legame con i cationi.20 Queste ripetizioni sono composte prevalentemente da filamenti β,21 che sono stati previsti per ripiegarsi in una struttura ad elica β.19 L’elica β è altamente conservata nell’evoluzione, e il modello per una catena α dell’integrina contiene 7 ripetizioni di fogli β che sono disposti come pale di elica intorno ad un asse centrale.19 Il legame del ligando è stato proposto per avvenire sulla faccia opposta ai siti di legame cationico che si trovano sul fondo di questa struttura.19

Trombastenia di Glanzmann

La trombastenia di Glanzmann è una malattia autosomica recessiva che risulta in una deficienza funzionale dei recettori GPIIb/IIIa.2 Questa malattia che dura tutta la vita è caratterizzata da emorragie mucocutanee, con epistassi e porpora comuni nell’infanzia e menorragia comune durante gli anni fertili e che causa una morbilità significativa. Il segno distintivo di questa malattia è l’aggregazione piastrinica gravemente ridotta o assente in risposta a molteplici agonisti fisiologici. Questa malattia è causata da mutazioni nei geni che codificano la GPIIb o la GPIIIa che risultano in anomalie qualitative o quantitative delle proteine di membrana piastrinica.23 La caratterizzazione molecolare della trombastenia di Glanzmann nei pazienti e nelle loro famiglie ha permesso di individuare i portatori basati sul DNA e di effettuare diagnosi prenatali.2223 Negli ultimi anni, il numero di mutazioni che sono state identificate a livello molecolare è aumentato,3 formando così la base di un database Internet che include informazioni cliniche, biochimiche e di mutazione sui pazienti segnalati (http://med.mssm.edu/glanzmanndb).

Mutazioni all’interno della sequenza dell’elica β di una catena di Integrina α

Stanno cominciando ad emergere diversi gruppi di mutazioni della trombastenia di Glanzmann che si trovano all’interno dell’elica GPIIb β. Un gruppo di mutazioni si trova all’interno e intorno ai domini leganti il calcio, e un altro gruppo si trova all’interno e intorno alla terza lama dell’elica (Figura 1). Quattro mutazioni missenso e 1 mutazione di delezione in-frame in 7 pazienti sono state identificate all’interno e intorno ai domini di legame del calcio, che si trovano all’interno della quarta alla settima pala dell’elica. Queste mutazioni influenzano il trasporto del complesso GPIIb/IIIa alla superficie cellulare e comprendono una sostituzione G273D(G242D) (paziente FLD),24 che precede il primo dominio di legame al calcio; sostituzioni E355K(E324K) (pazienti FL e Swiss)2526 e R358H(R327H) (pazienti KJ e Mila-1)2728, situate tra il secondo e terzo dominio di legame al calcio; una sostituzione G449D(G418D) (paziente LM)29 , che precede il quarto dominio legante il calcio; e una delezione V425D426 (paziente LeM)30 all’inizio del quarto dominio legante il calcio. Un altro gruppo di mutazioni si trova nelle vicinanze della terza lama (W3) dell’elica β, che contiene una struttura β-turn predetta che è stata implicata nel legame al ligando di GPIIb/IIIa e altri recettori integrinici.3132 Quattro mutazioni missenso in 5 pazienti risultano in recettori funzionalmente difettosi. Una sostituzione T207I(T176I) (Francoforte I)33 si trova nel filamento di collegamento 1-2, una sostituzione L214P(L183P) (paziente LW)34 si trova alla fine del secondo filamento β vicino al filamento di collegamento 2-3, e le sostituzioni P176A(P145A) (Mennonite)35 e P176L(P145L)35 si trovano nel filamento di collegamento 4-1 tra la seconda e terza pala dell’elica. Un supporto indipendente all’importanza funzionale di questa regione è stato dimostrato da una mutazione D255V(D224V),36 situata all’interno del filamento di collegamento 4-1 tra la terza e la quarta pala dell’elica. Questa mutazione è stata identificata da recettori GPIIb/IIIa mutanti generati in vitro ed espressi sulla superficie di cellule ovariche di criceto cinese37 e interrompe la funzione di legame al ligando del recettore.

Mutazioni all’interno del MIDAS di GPIIIa

Otto mutazioni missenso identificate in 9 pazienti con trombastenia di Glanzmann sono localizzate all’interno della sfera di legame ai cationi del dominio MIDAS di GPIIIa (Figura 2). Due mutazioni, D145Y(D119Y) (variante Cam)38 e D145N(D119N) (paziente NR),39 si trovano all’interno del motivo aminoacidico conservato DXSXS; 3 mutazioni, R240W(R214W) (variante Strasburgo I e paziente CM),4041 R240Q(R214Q) (paziente ET),42 e R242Q(R216Q) (paziente SH),43 si trovano vicino ai siti putativi di coordinamento17 ; e 3 mutazioni, D143W(D117W) (paziente MK),44 S188L(S162L) (paziente BL),45 e L288P(L262P) (paziente LD),46 si trovano all’interno della sfera del dominio MIDAS. Le mutazioni al residuo D119 risultano in gravi anomalie della funzione di GPIIb/IIIa ma non influenzano l’espressione di superficie, mentre la mutazione a D117 risulta nella ritenzione intracellulare di complessi recettoriali mal piegati. Le mutazioni ai residui R214 e R216 risultano in recettori GPIIb/IIIa espressi in superficie che sono anormalmente sensibili alla dissociazione dalla chelazione del calcio, e le mutazioni ai residui S162 e L262 risultano in livelli di espressione superficiale ≈30% del normale ma mostrano anche sensibilità alla dissociazione dal calcio. L’importanza di questi siti è rafforzata dall’identificazione di un gruppo di recettori GPIIb/IIIa mutanti generati in vitro ed espressi in cellule ovariche di criceto cinese.37 Le mutazioni D119N, R214W, D217N, E220Q, e E220K sono state identificate come difetti funzionali, fornendo un supporto indipendente per l’importanza del dominio MIDAS nel legame del ligando.

Mutazioni che influenzano l’attivazione del recettore

Sono state identificate due mutazioni della trombastenia di Glanzmann che alterano lo stato di attivazione del recettore GPIIb/IIIa. Entrambe le mutazioni sono localizzate all’interno del dominio citoplasmatico di GPIIIa, che è importante per l’attivazione dell’integrina e la regolazione del legame con il ligando.47 Le mutazioni sono una mutazione senza senso R750X(R724X) (paziente RM),48 che risulta nella delezione dei 39 residui carbossi-terminali di GPIIIa, e una mutazione senza senso S778P(S752P) (paziente P o Paris I).49 Le piastrine a riposo di entrambi i pazienti esprimono livelli significativi di complessi GPIIb/IIIa stabili che non rispondono agli agonisti ma rispondono agli attivatori conformazionali. Le analisi funzionali mostrano un’adesione normale al fibrinogeno immobilizzato ma una diffusione cellulare anormale. La mutazione S778P(S752P) mostra una ridotta formazione di placche di adesione focale, e la mutazione R750X(R724X) mostra una fosforilazione della tirosina della chinasi di adesione focale pp125FAK non rilevabile. Queste mutazioni forniscono un supporto al ruolo della coda citoplasmatica della GPIIIa nella funzione del complesso del recettore GPIIb/IIIa.

Conclusione

Il nostro apprezzamento per la diversità delle anomalie alla base della trombastenia di Glanzmann è stato arricchito dalla caratterizzazione molecolare dei difetti mutazionali identificati nei pazienti affetti da questo disturbo. Le mutazioni possono essere definite con precisione e gruppi distinti di difetti mutazionali possono ora essere identificati. La caratterizzazione molecolare dei pazienti con questo disordine ha fornito le basi per l’individuazione dei portatori basata sul DNA e le diagnosi prenatali della trombastenia di Glanzmann. Poiché la base strutturale dei recettori integrinici comincia a dispiegarsi, le mutazioni identificate faranno luce sui meccanismi di formazione del complesso recettore-ligando. Le informazioni generate da questi studi continueranno a fornire informazioni sulla biogenesi, la struttura e la funzione della famiglia di recettori di adesione GPIIb/IIIa e integrina.