Receptores de Glicoproteína IIb/IIIa Platelet e Thrombasthenia de Glanzmann

A agregação de plaquetas e formação de fibrina são essenciais para a manutenção de hemostasia normal, um sistema concebido para agir rápida e eficazmente para parar a hemorragia. Este sistema é também desencadeado por eventos patogénicos, tais como a ruptura de uma placa aterosclerótica, que pode levar a vaso-oclusão trombótica, isquemia, e enfarte. As plaquetas são um dos principais contribuintes para estes fenómenos trombóticos prejudiciais e ameaçadores da vida devido às suas propriedades adesivas, que resultam na libertação de mediadores solúveis, agregação plaquetária, e aumento da geração de trombina.1 O receptor da glicoproteína plaquetária IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) é um componente chave no caminho para a agregação plaquetária; consequentemente, este receptor tornou-se o alvo de intervenção terapêutica. Um paradigma desta modalidade de tratamento antiplaquetária encontra-se naturalmente na doença hereditária trombasténica de Glanzmann. Uma característica chave desta doença é que os doentes presentes com hemorragia mucocutânea, mas só raramente demonstram uma hemorragia espontânea do sistema nervoso central,2 uma complicação temida da terapia anticoagulante e antiplaquetária. Todas as mutações que foram identificadas em doentes com trombasténia de Glanzmann resultam numa deficiência funcional dos receptores GPIIb/IIIa,23 e uma marca distintiva desta doença é a ausência de agregação plaquetária induzida por agonistas. A caracterização molecular das mutações que causam a trombasténia de Glanzmann forneceu uma grande quantidade de informação sobre as relações estrutura-função do receptor GPIIb/IIIa. Esta análise irá resumir brevemente as mutações que afectam os domínios ligantes e a activação do receptor e apresentá-las no contexto das estruturas previstas. Uma cobertura mais abrangente pode ser encontrada em revisões discutindo a estrutura e função do complexo receptor GPIIb/IIIa45 e a base clínica e molecular da trombasténia de Glanzmann.23

Receptor GPIIb/IIIa

Platelets são a primeira linha de defesa na prevenção da perda de sangue de vasos sanguíneos lesionados através do reconhecimento e adesão a componentes da matriz subendotelial. Este evento é seguido pela formação de um tampão de plaquetas devido ao recrutamento de plaquetas adicionais por ligação e reticulação de moléculas de grandes ligantes, como o fibrinogénio e o factor von Willebrand. Além disso, plaquetas activadas fornecem uma superfície para componentes de coagulação do sangue, facilitando assim a geração de trombina.67 A agregação plaquetária é mediada pelo receptor GPIIb/IIIa (integrin αIIbβ3), um dos receptores de superfície celular mais abundantes (≈80 000 por plaqueta),8 que representa ≈15% da proteína de superfície total.9 Em plaquetas quiescentes, este receptor exibe uma afinidade mínima de ligação ao factor von Willebrand e ao fibrinogénio plasmático. Num estado activado, os mecanismos de transdução de sinal “inside-out “5 provocam uma mudança conformacional no receptor para um estado de ligação ligante de alta afinidade que é competente para ligar glicoproteínas adesivas e formar um tampão plaquetário. Após ligação ligand, mecanismos de transdução de sinal “outside-in “5 medeiam interacções integrina-citoesqueletograma. Estes demonstraram ser requisitos para eventos de ocupação pós-ligand, tais como propagação celular e formação de sítios de adesão focal.10

Modos de reconhecimento de integrina para receptores de integrina requerem um aminoácido ácido para actividade. O primeiro exemplo de um peptídeo ácido que confere reconhecimento de integrina foi a sequência Arg-Gly-Asp (RGD) em fibronectina.11 Outras moléculas de matriz extracelular foram encontradas para conter esta sequência, e o conceito de RGD como um motivo de reconhecimento comum foi adoptado.12 O motivo RGD encontra-se em ligandos de receptores GPIIb/IIIa incluindo a cadeia α de fibrinogénio e o factor von Willebrand, mas um motivo de reconhecimento Lys/Gly-Asp (K/GD), encontrado dentro de uma sequência única de dodecapeptídeos na cadeia γ de fibrinogénio, é necessário e suficiente para a agregação plaquetária mediada pelo fibrinogénio.13

Devido à ausência de uma estrutura cristalina, está disponível informação menos precisa sobre os sítios dentro dos receptores de integrina que reconhecem ligandos. A informação estrutural está disponível para 1 região ligante ligante, que é o domínio von Willebrand factor A ou I (inserido).14 O domínio I é expresso por um subconjunto de subunidades da cadeia α, e a cristalografia de alta resolução estabeleceu este domínio como parte de um site único de coordenação de metais designado site de adesão dependente de iões metálicos (MIDAS).14 O domínio I não está presente na subunidade GPIIb (αIIb), mas estudos estruturais identificaram uma região de características semelhantes de ligação de catiões em integrin β subunidades.15 Vários modelos estruturais foram gerados mostrando a associação conformacional de resíduos de aminoácidos previstos para desempenhar um papel directo na ligação ligante.161718

Um modelo estrutural do domínio ligante-ligante-ligante-ligante de uma cadeia integrin α foi previsto pela modelação por computador.19 A sequência ligante-ligante-ligante mínima de GPIIb é composta pelo amino-terminal 450 aminoácidos, que contém 7 repetições homólogas com 4 sítios de ligação catiónica.20 Estas repetições são compostas predominantemente de cordões β,21 que foram previstos para serem dobrados numa estrutura propulsora β.19 A hélice β está altamente conservada em evolução, e o modelo para uma cadeia integrin α contém 7 repetições de folhas de β que estão dispostas como pás propulsoras em torno de um eixo central.19 Foi proposta a encadernação ligand na face oposta aos sítios de encadernação de catiões que se encontram na base desta estrutura.19

Trombasténia de Glanzmann

p>Trombasténia de Glanzmann é uma doença autossómica recessiva que resulta numa deficiência funcional dos receptores GPIIb/IIIa.2 Esta desordem vitalícia é caracterizada por hemorragia mucocutânea, sendo a epistaxe e a púrpura comuns na infância e a menorragia comuns durante os anos de vida das crianças e causando uma morbilidade significativa. A marca desta doença é gravemente reduzida ou a ausência de agregação plaquetária em resposta a múltiplos agonistas fisiológicos. Esta doença é causada por mutações nos genes que codificam GPIIb ou GPIIIa que resultam em anomalias qualitativas ou quantitativas das proteínas da membrana plaquetária.23 A caracterização molecular da trombasténia de Glanzmann nos doentes e suas famílias permitiu a detecção de portadores de ADN e a realização de diagnósticos pré-natais.2223 Nos últimos anos, o número de mutações que foram identificadas a nível molecular aumentou,3 formando assim a base de uma base de dados da Internet que inclui informação clínica, bioquímica, e informação sobre mutações em pacientes notificados (http://med.mssm.edu/glanzmanndb).

Mutações dentro da cadeia β-Propeller Sequence of an Integrin α Chain

Diferentes grupos de mutações trombasténicas de Glanzmann que se encontram dentro da hélice GPIIb β começam a surgir. Um grupo de mutações está localizado dentro e em redor dos domínios de ligação do cálcio, e outro grupo está localizado dentro e em redor da terceira pá da hélice (Figura 1). Foram identificadas quatro mutações de erro e uma mutação de apagamento na estrutura em 7 pacientes dentro e em redor dos domínios de ligação do cálcio, que se encontram dentro da quarta a sétima pás da hélice. Estas mutações afectam o transporte do complexo GPIIb/IIIa para a superfície celular e incluem uma substituição G273D(G242D) (paciente FLD),24 que precede o primeiro domínio de ligação do cálcio; E355K(E324K) (pacientes FL e Swiss)2526 e R358H(R327H) (pacientes KJ e Mila-1)2728 substituições, localizadas entre o segundo e o terceiro domínios de ligação do cálcio; uma substituição G449D(G418D) (paciente LM)29, que precede o quarto domínio de ligação de cálcio; e uma eliminação V425D426 (paciente LeM)30 no início do quarto domínio de ligação de cálcio. Outro grupo de mutações está localizado na proximidade da terceira lâmina (W3) da hélice β, que contém uma estrutura de rotação prevista β que foi implicada na ligadura de GPIIb/IIIa e outros receptores integrantes.3132 Quatro mutações de missense em 5 pacientes resultam em receptores funcionalmente defeituosos. Uma substituição T207I(T176I) (Frankfurt I)33 está localizada no cordão de ligação 1-2, uma substituição L214P(L183P) (paciente LW)34 está localizada no final do segundo cordão β perto do cordão de ligação 2-3, e as substituições P176A(P145A) (Mennonite)35 e P176L(P145L)35 estão localizadas dentro do cordão de ligação 4-1 entre a segunda e terceira pás da hélice. O apoio independente à importância funcional desta região foi demonstrado por uma mutação D255V(D224V),36 localizada dentro do cordão de ligação 4-1 entre a terceira e a quarta pás da hélice. Esta mutação foi identificada a partir de receptores GPIIb/IIIa mutantes gerados in vitro expressos na superfície das células do ovário do hamster chinês37 e perturba a função de ligação ligando o receptor.

Mutações Dentro da MIDAS de GPIIIa

Oito mutações de missense identificadas em 9 pacientes com trombasténia de Glanzmann estão localizadas dentro da esfera de ligação dos catiões do domínio MIDAS de GPIIIa (Figura 2). Duas mutações, D145Y(D119Y) (variante Cam)38 e D145N(D119N) (paciente NR),39 estão localizadas dentro do motivo conservado DXSXS aminoácido; 3 mutações, R240W(R214W) (variante Strasbourg I e paciente CM),4041 R240Q(R214Q) (paciente ET),42 e R242Q(R216Q) (paciente SH),43 estão localizadas perto dos locais de coordenação putativa17 ; e 3 mutações, D143W(D117W) (doente MK),44 S188L(S162L) (doente BL),45 e L288P(L262P) (doente LD),46 estão localizados dentro da esfera do domínio MIDAS. As mutações no resíduo D119 resultam em anomalias graves da função GPIIb/IIIa mas não afectam a expressão superficial, enquanto que a mutação em D117 resulta na retenção intracelular de complexos receptores desdobrados. As mutações nos resíduos R214 e R216 resultam em receptores GPIIb/IIIa de superfície expressa, que são anormalmente sensíveis à dissociação por quelação do cálcio, e as mutações nos resíduos S162 e L262 resultam em níveis de expressão superficial ≈30% do normal, mas também mostram sensibilidade à dissociação por cálcio. A importância destes sítios é reforçada pela identificação de um grupo de receptores de GPIIb/IIIa mutantes in vitro, expressos em células de ovários de hamster chineses.37 As mutações D119N, R214W, D217N, E220Q, e E220K foram identificadas como defeitos funcionais, fornecendo apoio independente para a importância do domínio MIDAS em ligand binding.

Mutações que afectam a activação do receptor

duas mutações trombásticas de Glanzmann que perturbam o estado de activação do receptor GPIIb/IIIa foram identificadas. Ambas as mutações estão localizadas dentro do domínio citoplasmático GPIIIa, o que é importante para a activação da integrina e para a regulação da ligação ligand.47 As mutações são uma mutação sem sentido R750X(R724X) (paciente RM),48 que resulta na eliminação dos resíduos carboxi-terminal 39 de GPIIIa, e uma mutação com sentido errado S778P(S752P) (paciente P ou Paris I).49 As plaquetas em repouso de ambos os pacientes expressam níveis significativos de complexos estáveis de GPIIb/IIIa que não respondem aos agonistas mas respondem aos activadores conformacionais. As análises funcionais mostram uma aderência normal ao fibrinogénio imobilizado, mas uma difusão celular anormal. A mutação S778P(S752P) mostra formação reduzida da placa de aderência focal, e a mutação R750X(R724X) mostra fosforilação indetectável de tirosina de aderência focal kinase pp125FAK. Estas mutações apoiam o papel da cauda citoplasmática GPIIIa na função do complexo receptor GPIIb/IIIa.

Conclusão

A nossa apreciação da diversidade de anomalias subjacentes à trombasténia de Glanzmann foi enriquecida pela caracterização molecular de defeitos mutacionais identificados em doentes afectados por esta doença. As mutações podem ser definidas com precisão, e grupos distintos de defeitos mutacionais podem agora ser identificados. A caracterização molecular de pacientes com esta desordem forneceu a base para a detecção de portadores baseados em ADN e diagnósticos pré-natais da trombasténia de Glanzmann. À medida que a base estrutural dos receptores de integrina começa a desdobrar-se, as mutações identificadas irão lançar luz sobre os mecanismos de formação do complexo receptor-ligante. A informação gerada a partir destes estudos continuará a fornecer uma visão da biogénese, estrutura, e função do GPIIb/IIIa e da família de receptores de adesão integrina.

Footnotes