Receptores plaquetarios de la glucoproteína IIb/IIIa y trombastenia de Glanzmann

La agregación plaquetaria y la formación de fibrina son esenciales para el mantenimiento de la hemostasia normal, un sistema diseñado para actuar rápida y eficazmente para detener la hemorragia. Este sistema también se desencadena ante acontecimientos patógenos, como la rotura de una placa aterosclerótica, que puede provocar una oclusión vascular trombótica, isquemia e infarto. Las plaquetas contribuyen en gran medida a estos fenómenos trombóticos dañinos y potencialmente mortales debido a sus propiedades adhesivas, que dan lugar a la liberación de mediadores solubles, la agregación plaquetaria y el aumento de la generación de trombina.1 El receptor de la glucoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) de las plaquetas es un componente clave en la vía de agregación plaquetaria; por consiguiente, este receptor se ha convertido en el objetivo de la intervención terapéutica. Un paradigma de esta modalidad de tratamiento antiplaquetario se encuentra naturalmente en el trastorno hereditario de la trombastenia de Glanzmann. Una característica clave de esta enfermedad es que los pacientes presentan hemorragias mucocutáneas, pero sólo en raras ocasiones demuestran una hemorragia espontánea del sistema nervioso central,2 una temida complicación del tratamiento anticoagulante y antiplaquetario. Todas las mutaciones que se han identificado en pacientes con trombastenia de Glanzmann dan lugar a una deficiencia funcional de los receptores GPIIb/IIIa,23 y una característica distintiva de esta enfermedad es la ausencia de agregación plaquetaria inducida por agonistas. La caracterización molecular de las mutaciones causantes de la trombastenia de Glanzmann ha proporcionado una gran cantidad de información sobre las relaciones estructura-función del receptor GPIIb/IIIa. Esta revisión resumirá brevemente las mutaciones que afectan a los dominios de unión al ligando y a la activación del receptor y las presentará en el contexto de las estructuras predichas. Se puede encontrar una cobertura más completa en las revisiones que discuten la estructura y la función del complejo del receptor GPIIb/IIIa45 y las bases clínicas y moleculares de la trombastenia de Glanzmann.23

Receptor GPIIb/IIIa

Las plaquetas son la primera línea de defensa en la prevención de la pérdida de sangre de los vasos sanguíneos lesionados mediante el reconocimiento y la adhesión a los componentes de la matriz subendotelial. A este acontecimiento le sigue la formación de un tapón plaquetario debido al reclutamiento de plaquetas adicionales mediante la unión y reticulación de grandes moléculas de ligando, como el fibrinógeno y el factor de von Willebrand. Además, las plaquetas activadas proporcionan una superficie para los componentes de la coagulación sanguínea, facilitando así la generación de trombina.67 La agregación plaquetaria está mediada por el receptor GPIIb/IIIa (integrina αIIbβ3), uno de los receptores más abundantes de la superficie celular (≈80 000 por plaqueta),8 que representa ≈15% de la proteína de superficie total.9 En las plaquetas quiescentes, este receptor presenta una afinidad de unión mínima por el factor von Willebrand y el fibrinógeno plasmático. En un estado activado, los mecanismos de transducción de señales «de dentro a fuera «5 desencadenan un cambio conformacional en el receptor hacia un estado de unión al ligando de alta afinidad que es competente para unir glicoproteínas adhesivas y formar un tapón plaquetario. Después de la unión del ligando, los mecanismos de transducción de señales «outside-in «5 median las interacciones entre la integrina y el citoesqueleto. Se ha demostrado que estos son requisitos para los eventos posteriores a la ocupación del ligando, como la propagación celular y la formación de sitios de adhesión focal.10

Los motivos de reconocimiento del ligando para los receptores de integrina requieren un aminoácido ácido para su actividad. El primer ejemplo de un péptido ácido que confiere reconocimiento a la integrina fue la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) en la fibronectina.11 Se descubrió que otras moléculas de la matriz extracelular contenían esta secuencia, y se adoptó el concepto de RGD como motivo de reconocimiento común.12 El motivo RGD se encuentra en los ligandos de los receptores GPIIb/IIIa, incluida la cadena α del fibrinógeno y el factor von Willebrand, pero un motivo de reconocimiento Lys/Gly-Asp (K/GD), que se encuentra dentro de una secuencia dodecapéptida única en la cadena γ del fibrinógeno, es necesario y suficiente para la agregación plaquetaria mediada por el fibrinógeno.13

Debido a la ausencia de una estructura cristalina, se dispone de información menos precisa sobre los sitios dentro de los receptores de integrina que reconocen ligandos. Se dispone de información estructural para 1 región de unión a ligandos, que es el dominio A o I (insertado) del factor von Willebrand.14 El dominio I se expresa en un subconjunto de subunidades de cadena α, y la cristalografía de alta resolución ha establecido este dominio como parte de un sitio de coordinación metálica único designado como sitio de adhesión dependiente de iones metálicos (MIDAS).14 El dominio I no está presente en la subunidad GPIIb (αIIb), pero los estudios estructurales han identificado una región de características de unión a cationes similares en las subunidades β de integrina.15 Se han generado varios modelos estructurales que muestran la asociación conformacional de los residuos de aminoácidos que se predice que desempeñan un papel directo en la unión del ligando.161718

Se ha predicho un modelo estructural del dominio de unión al ligando de una cadena de integrina α mediante modelado informático.19 La secuencia mínima de unión al ligando de la GPIIb está compuesta por los 450 aminoácidos aminoterminales, que contienen 7 repeticiones homólogas con 4 sitios de unión a cationes.20 Estas repeticiones se componen predominantemente de láminas β,21 que se ha predicho que se pliegan en una estructura de hélice β.19 La hélice β está muy conservada en la evolución, y el modelo para una cadena α de integrina contiene 7 repeticiones de láminas β que se disponen como palas de hélice alrededor de un eje central.19 Se ha propuesto que la unión del ligando tiene lugar en la cara opuesta a los sitios de unión a cationes que se encuentran en la parte inferior de esta estructura.19

Trombastenia de Glanzmann

La trombastenia de Glanzmann es una enfermedad autosómica recesiva que da lugar a una deficiencia funcional de los receptores GPIIb/IIIa.2 Este trastorno, que dura toda la vida, se caracteriza por la aparición de hemorragias mucocutáneas, siendo frecuentes la epistaxis y la púrpura en la infancia y la menorragia durante la edad fértil, causando una morbilidad significativa. El rasgo distintivo de esta enfermedad es la severa reducción o ausencia de agregación plaquetaria en respuesta a múltiples agonistas fisiológicos. Esta enfermedad está causada por mutaciones en los genes que codifican la GPIIb o la GPIIIa que dan lugar a anomalías cualitativas o cuantitativas de las proteínas de la membrana plaquetaria.23 La caracterización molecular de la trombastenia de Glanzmann en pacientes y sus familias ha permitido la detección de portadores basada en el ADN y la realización de diagnósticos prenatales.2223 En los últimos años, el número de mutaciones que se han identificado a nivel molecular ha aumentado,3 constituyendo así la base de una base de datos en Internet que incluye información clínica, bioquímica y de mutaciones de los pacientes reportados (http://med.mssm.edu/glanzmanndb).

Mutaciones dentro de la secuencia de la hélice β de una cadena de integrina α

Empiezan a surgir diferentes grupos de mutaciones de la trombastenia de Glanzmann que se localizan dentro de la hélice β de la GPIIb. Un grupo de mutaciones se localiza dentro y alrededor de los dominios de unión al calcio, y otro grupo se localiza dentro y alrededor de la tercera pala de la hélice (Figura 1). Se han identificado cuatro mutaciones de sentido erróneo y una mutación de deleción dentro del marco en 7 pacientes dentro y alrededor de los dominios de unión al calcio, que se encuentran dentro de las palas cuarta a séptima de la hélice. Estas mutaciones afectan al transporte del complejo GPIIb/IIIa a la superficie celular e incluyen una sustitución G273D(G242D) (paciente FLD),24 que precede al primer dominio de unión al calcio; sustituciones E355K(E324K) (pacientes FL y Swiss)2526 y R358H(R327H) (pacientes KJ y Mila-1)2728 , situadas entre el segundo y el tercer dominio de unión al calcio; una sustitución G449D(G418D) (paciente LM)29, que precede al cuarto dominio de unión al calcio; y una deleción V425D426 (paciente LeM)30 al principio del cuarto dominio de unión al calcio. Otro grupo de mutaciones se localiza en las proximidades de la tercera hoja (W3) de la hélice β, que contiene una estructura de giro β predicha que se ha implicado en la unión al ligando de la GPIIb/IIIa y otros receptores de integrina.3132 Cuatro mutaciones sin sentido en 5 pacientes dan lugar a receptores funcionalmente defectuosos. Una sustitución T207I(T176I) (Frankfurt I)33 se localiza en la hebra de conexión 1-2, una sustitución L214P(L183P) (paciente LW)34 se localiza en el extremo de la segunda hebra β cerca de la hebra de conexión 2-3, y las sustituciones P176A(P145A) (Mennonite)35 y P176L(P145L)35 se localizan dentro de la hebra de conexión 4-1 entre la segunda y la tercera hoja de la hélice. Una mutación D255V(D224V),36 situada en la cadena de conexión 4-1 entre la tercera y la cuarta pala de la hélice, ha demostrado la importancia funcional de esta región. Esta mutación se identificó a partir de receptores GPIIb/IIIa mutantes generados in vitro y expresados en la superficie de células de ovario de hámster chino37 e interrumpe la función de unión al ligando del receptor.

Mutaciones dentro del MIDAS de GPIIIa

Ocho mutaciones sin sentido identificadas en 9 pacientes con trombastenia de Glanzmann están localizadas dentro de la esfera de unión a cationes del dominio MIDAS de GPIIIa (Figura 2). Dos mutaciones, D145Y(D119Y) (variante Cam)38 y D145N(D119N) (paciente NR),39 están localizadas dentro del motivo aminoácido conservado DXSXS; 3 mutaciones, R240W(R214W) (variante Strasbourg I y paciente CM),4041 R240Q(R214Q) (paciente ET),42 y R242Q(R216Q) (paciente SH),43 están localizadas cerca de los sitios putativos de coordinación17 ; y 3 mutaciones, D143W(D117W) (paciente MK),44 S188L(S162L) (paciente BL),45 y L288P(L262P) (paciente LD),46 están localizadas dentro de la esfera del dominio MIDAS. Las mutaciones en el residuo D119 dan lugar a graves anomalías en la función de la GPIIb/IIIa, pero no afectan a la expresión en la superficie, mientras que la mutación en D117 da lugar a la retención intracelular de complejos de receptores mal plegados. Las mutaciones en los residuos R214 y R216 dan lugar a receptores GPIIb/IIIa expresados en superficie que son anormalmente sensibles a la disociación por quelación de calcio, y las mutaciones en los residuos S162 y L262 dan lugar a niveles de expresión en superficie ≈30% de lo normal pero también muestran sensibilidad a la disociación por calcio. La importancia de estos sitios se ve reforzada por la identificación de un grupo de receptores GPIIb/IIIa mutantes generados in vitro y expresados en células de ovario de hámster chino.37 Las mutaciones D119N, R214W, D217N, E220Q y E220K se identificaron como defectos funcionales, proporcionando un apoyo independiente a la importancia del dominio MIDAS en la unión del ligando.

Mutaciones que afectan a la activación del receptor

Se han identificado dos mutaciones de la trombastenia de Glanzmann que alteran el estado de activación del receptor GPIIb/IIIa. Ambas mutaciones están localizadas dentro del dominio citoplasmático de la GPIIIa, que es importante para la activación de la integrina y la regulación de la unión del ligando47. Las mutaciones son una mutación sin sentido R750X(R724X) (paciente RM),48 que da lugar a la supresión de los 39 residuos carboxi-terminales de la GPIIIa, y una mutación sin sentido S778P(S752P) (paciente P o París I).49 Las plaquetas en reposo de ambos pacientes expresan niveles significativos de complejos GPIIb/IIIa estables que no responden a los agonistas pero sí a los activadores conformacionales. Los análisis funcionales muestran una adhesión normal al fibrinógeno inmovilizado pero una propagación celular anormal. La mutación S778P(S752P) muestra una formación reducida de placas de adhesión focal, y la mutación R750X(R724X) muestra una fosforilación de tirosina indetectable de la cinasa de adhesión focal pp125FAK. Estas mutaciones apoyan el papel de la cola citoplasmática de la GPIIIa en la función del complejo de receptores GPIIb/IIIa.

Conclusión

Nuestra apreciación de la diversidad de anomalías que subyacen a la trombastenia de Glanzmann se ha visto enriquecida por la caracterización molecular de los defectos mutacionales identificados en pacientes afectados por este trastorno. Las mutaciones pueden definirse con precisión y ahora pueden identificarse distintos grupos de defectos mutacionales. La caracterización molecular de los pacientes con este trastorno ha proporcionado la base para la detección de portadores basada en el ADN y el diagnóstico prenatal de la trombastenia de Glanzmann. A medida que la base estructural de los receptores de integrinas comienza a desarrollarse, las mutaciones identificadas arrojarán luz sobre los mecanismos de formación de complejos receptor-ligando. La información generada a partir de estos estudios seguirá proporcionando información sobre la biogénesis, la estructura y la función de la familia de receptores de adhesión GPIIb/IIIa e integrinas.

Figura 1. Trombastenia de Glanzmann y mutaciones generadas in vitro localizadas dentro de una estructura de hélice β de una subunidad de cadena α de integrina. Dibujo esquemático de una estructura de hélice β de 7 láminas que se predice que representa la región de unión al ligando de una subunidad de cadena α de integrina.19 Cada lámina (1 a 7) está compuesta por hebras β antiparalelas (flechas numeradas de 1 a 4, como se muestra en la lámina 1) que están conectadas por bucles de horquilla. Los 4 dominios de unión al calcio (líneas punteadas azules) están incluidos dentro de los 1-2 bucles de conexión dentro de las láminas 4 a 7. Se ha planteado la hipótesis de que estos dominios están situados en la parte inferior de la hélice y se encuentran frente a los sitios de unión del ligando.19 Las localizaciones de 8 mutaciones de sentido erróneo y 1 mutación de deleción identificadas en 12 pacientes con trombastenia de Glanzmann están representadas por círculos rojos; la mutación generada in vitro localizada entre la tercera y la cuarta pala de la hélice está representada por un círculo abierto en rojo.

Figura 2. Mutaciones de la trombastenia de Glanzmann localizadas en las proximidades del dominio MIDAS de la GPIIIa (β3). Un dibujo esquemático muestra el patrón de plegado previsto de una estructura de dominio del factor A de von Willebrand de GPIIIa en la que un dominio MIDAS está situado en el centro de la estructura.17 Este dibujo se ha modificado para incluir las mutaciones identificadas en pacientes con trombastenia de Glanzmann. Las flechas de la A a la F representan las hojas β predichas, y los cilindros del 1 al 7 representan las estructuras de α-hélice predichas. El motivo de unión de cationes D119XS121XS123 y los residuos de coordinación D217 y E220 se muestran en círculos negros. Las localizaciones de 8 mutaciones identificadas en 9 pacientes con trombastenia de Glanzmann se representan con círculos rojos.

Notas al pie

Correspondencia a Deborah L. French, PhD, Box 1079 Hematology, Mount Sinai School of Medicine, One Gustave L. Levy Place, New York, NY 10029. Correo electrónico

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