La PCR quantitativa in tempo reale, o qPCR, è un metodo standard per rilevare e quantificare una specifica sequenza target, o quantificare i livelli di espressione genica in un campione. Nella qPCR, sonde o acidi nucleici marcati in modo fluorescente o coloranti fluorescenti che legano il DNA a doppio filamento sono incorporati nella reazione di PCR e la formazione del prodotto è monitorata in tempo reale dopo ogni ciclo di PCR.
La qPCR basata sulla sonda utilizza un primer o una sonda fluorescente per rilevare il prodotto di amplificazione. Un vantaggio di questo metodo è che permette la rilevazione sequenza-specifica del target e riduce la probabilità di rilevare artefatti aspecifici. Il rilevamento basato sulla sonda può anche adattarsi all’amplificazione multipla utilizzando sonde marcate in modo differenziato. Ci sono diversi approcci al rilevamento qPCR basato su sonde, tra cui sonde di idrolisi come TaqMan®, sonde di ibridazione, sonde hairpin e primer etichettati.
L’uso di coloranti fluorescenti che legano il DNA, come BRYT® Green o SYBR® Green, è uno degli approcci qPCR più semplici. Un colorante viene aggiunto alla reazione e la fluorescenza viene misurata ad ogni ciclo di PCR. Poiché la fluorescenza di questi coloranti aumenta drasticamente in presenza di DNA a doppio filamento, la sintesi del DNA può essere monitorata come un aumento del segnale fluorescente.
L’output primario di un esperimento di PCR in tempo reale è una curva di amplificazione che mostra l’accumulo del prodotto amplificato come segnale fluorescente rispetto al numero di cicli.
La quantificazione della quantità di materiale di partenza viene fatta usando il ciclo di quantificazione (Cq, noto anche come Ct). Cq o Ct (ciclo di soglia) è il ciclo di amplificazione al quale il segnale di fluorescenza rilevato raggiunge una soglia di amplificazione in un pozzetto specifico. La soglia di amplificazione è calcolata in base alla fluorescenza di fondo sulla regione della linea di base di tutte le curve del gruppo e rappresenta il punto in cui il segnale del reporter è significativamente più alto dei livelli di fondo. Cq è inversamente correlato alla quantità di template di partenza nella reazione ed è una misura relativa della concentrazione del target nella reazione di PCR.