La PCR cuantitativa en tiempo real, o qPCR, es un método estándar para detectar y cuantificar una secuencia diana específica, o para cuantificar los niveles de expresión génica en una muestra. En la qPCR, se incorporan a la reacción de PCR sondas o ácidos nucleicos marcados con fluorescencia, o colorantes fluorescentes de unión al ADN de doble cadena, y la formación del producto se monitoriza en tiempo real tras cada ciclo de PCR.
La qPCR basada en sondas utiliza un cebador o sonda fluorescente para detectar el producto de amplificación. Una ventaja de este método es que permite la detección específica de la secuencia de la diana y reduce la probabilidad de detectar artefactos no específicos. La detección basada en sondas también puede adaptarse a la amplificación múltiple utilizando sondas marcadas de forma diferencial. Existen varios enfoques diferentes para la detección de qPCR basada en sondas, incluyendo sondas de hidrólisis como TaqMan®, sondas de hibridación, sondas de horquilla y cebadores marcados.
El uso de colorantes fluorescentes de unión al ADN, como BRYT® Green o SYBR® Green, es uno de los enfoques de qPCR más sencillos. Se añade un colorante a la reacción y se mide la fluorescencia en cada ciclo de PCR. Dado que la fluorescencia de estos colorantes aumenta drásticamente en presencia de ADN de doble cadena, la síntesis de ADN se puede monitorizar como un aumento de la señal fluorescente.
El resultado principal de un experimento de PCR en tiempo real es una curva de amplificación que muestra la acumulación de producto amplificado como señal fluorescente frente al número de ciclos.
La cuantificación de la cantidad de material de partida se realiza mediante el ciclo de cuantificación (Cq, también conocido como Ct). Cq o Ct (ciclo umbral) es el ciclo de amplificación en el que la señal de fluorescencia detectada alcanza un umbral de amplificación en un pozo específico. El umbral de amplificación se calcula basándose en la fluorescencia de fondo sobre la región de la línea de base de todas las curvas del grupo y representa el punto en el que la señal del reportero es significativamente mayor que los niveles de fondo. Cq está inversamente relacionado con la cantidad de plantilla inicial en la reacción y es una medida relativa de la concentración de la diana en la reacción de PCR.